蘇加坤，應(yīng)旭輝，羅娟敏，王義明，徐 達，羅國安，蔡繼寶*

(1.江西中煙工業(yè)有限責任公司，江西 南昌 330096;2.珠海清大弘瑞生物科技有限公司,廣東 珠海 519085;3.清華大學 化學系，北京 100084)

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天然本草添加卷煙煙氣暴露大鼠肺組織代謝組學研究

蘇加坤1，應(yīng)旭輝3，羅娟敏1，王義明2*，徐 達1，羅國安3，蔡繼寶1*

(1.江西中煙工業(yè)有限責任公司，江西 南昌 330096;2.珠海清大弘瑞生物科技有限公司,廣東 珠海 519085;3.清華大學 化學系，北京 100084)

應(yīng)用代謝組學方法，比較研究了普通卷煙和含有天然本草添加劑卷煙對大鼠肺組織代謝的影響。運用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分別分析了對照組、普通卷煙及某品牌天然本草添加卷煙煙氣暴露7,14,30 d時的大鼠肺組織樣品，對所得數(shù)據(jù)用偏最小二乘判別分析(PLS-DA)進行模式識別并篩選生物標志物。結(jié)果顯示，吸食普通卷煙和某品牌卷煙，均會損傷大鼠肺組織，造成磷脂代謝、脂肪酸代謝紊亂，其中有2只普通卷煙暴露組大鼠的肺組織樣品顯著異常，受到明顯的氧化損傷。綜合來看，特別是長時間煙氣暴露狀態(tài)下，吸食某品牌卷煙造成的肺組織損傷低于普通卷煙，表明煙草中添加天然本草在一定程度上可減輕煙氣對機體的損傷。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；代謝組學；天然本草添加卷煙；肺組織；生物標志物

吸煙有害健康早已得到人們的共識。為有效減少吸煙對人體健康的危害，國外煙草研究人員側(cè)重于優(yōu)化制煙工藝來降低卷煙的危害，如降低焦油釋放量，但實際效果遠不如預(yù)期[1-2]。我國學者自20世紀50年代起開始探討天然本草與煙草的關(guān)系，并將其添加到卷煙中，以達到減毒降害的作用[3]。

代謝組學是通過研究外界干預(yù)等因素對生物體內(nèi)代謝物造成的變化，從而更好地了解生物體的代謝過程[4-5]，目前已被用于煙草相關(guān)減害機理的研究，如Vulimiri等[6]利用代謝組學方法研究了煙草主流煙氣對肺上皮細胞的影響；石先哲等[7]用代謝組學方法研究了薄荷煙對大鼠尿液代謝的影響，認為在煙草中添加薄荷醇可減少煙草對大鼠的損傷。本研究運用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀結(jié)合PLS-DA模式識別分析研究了普通卷煙和某品牌天然本草添加卷煙對大鼠肺組織代謝的影響，以期對煙氣暴露引發(fā)的機體損傷及添加天然本草減害的機理進行解釋，為天然本草在煙草減害中的應(yīng)用提供科學依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

乙腈(質(zhì)譜級)、甲醇(色譜級)均購自Fisher公司(USA)，甲酸購自Acros公司(純度98%，比利時)。亮氨酸-腦啡肽標準品(純度≥97%，Leucine-enkephalin，LE)購于Sigma公司(USA)。LPC(16∶0)購于Avanti Polar Lipids公司(USA)?；ㄉ南┧?C20∶4)、亞油酸(C18∶2)、油酸(C18∶1)、棕櫚油酸、棕櫚酸購自Sigma-Aldrich公司(St.Louis，MO，USA)。實驗用水為超純水。

Waters AcquityTM超高效液相色譜系統(tǒng)(Waters，Millford，MA，USA)，配備高壓二元梯度泵、可控溫自動進樣器(最低4 ℃)和二極管陣列檢測器。質(zhì)譜檢測器為Waters Premier TOF飛行時間質(zhì)譜儀(Waters，Millford，MA，USA)，配有ESI電離源接口和Lock-spray接口。Milli-Q超純水系統(tǒng)(Millipore，Bedford，MD，USA)

1.2 動物實驗及樣本分析前處理

1.2.1 動物實驗 90只Wistar大鼠分成 3組，分為對照組(空白對照，不暴露于煙氣中)、普通卷煙組和某品牌天然本草添加卷煙組，每組30只，每組再分成3個小組，每個小組10只，分別煙氣暴露7，14,30 d。普通卷煙和某品牌天然本草添加卷煙均由江西中煙工業(yè)有限責任公司提供。每只大鼠每天分別暴露20 min，控制卷煙煙氣遮光率為70%，控制溫度為(22±2) ℃，濕度保持在(21±0.5)%，氧氣濃度保持在(21±0.5)%，壓力為(101 325±40) Pa。在煙氣暴露7,14,30 d時，分別給大鼠稱重，經(jīng)麻醉后取大鼠肺組織，用生理鹽水洗凈并用濾紙吸干水分，然后稱重，在-80 ℃下保存。

1.2.2 肺組織樣本前處理 取凍融后的肺組織樣品，按1∶3(g/mL)加入生理鹽水進行勻漿。取200 μL勻漿液，加入600 μL甲醇，渦旋2 min，于4 ℃下1 000 r/min離心15 min，取上清液過0.22 μm濾膜。

質(zhì)量控制(QC)樣品的制備：將煙氣暴露14 d的所有待測大鼠肺組織勻漿液取出等量部分混合均勻后，按樣品處理方法處理。

1.3 UPLC/Q-TOF-MS測定條件

色譜分離采用Waters公司AcquityTM-BEH C18反向分析柱(100 mm × 2.1 mm，i.d.1.7 μm，Waters，MA，USA)，柱溫為40 ℃，流速為0.4 mL/min。自動進樣器溫度設(shè)為4 ℃，每次進樣4 μL。流動相：A為純乙腈；B為0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫程序：0～2 min，20%～55%A；2～11 min，55%～75%A；11～12 min，75%～95%A；12～15 min，95%A；15～16 min，95%～20%A；16～19 min，20%A。

質(zhì)譜為電噴霧離子源(ESI)，分析采用“V”模式，在負離子模式下采集數(shù)據(jù)。檢測參數(shù)設(shè)置如下：脫溶劑氣流量600 L/h，脫溶劑氣溫度350 ℃，錐孔氣流量40 L/h，離子源溫度120 ℃，毛細管電壓2 500 V，錐孔電壓30 V。質(zhì)譜掃描范圍為100～1 500m/z，掃描時間0.2 s，掃描間隔0.02 s。準確質(zhì)量測定采用2 ng/mL亮氨酸-腦啡肽(Leucine-enkephalin，LE)溶液為鎖定質(zhì)量校準液，進行實時質(zhì)量校正，質(zhì)量校準選擇“DRE”模式，流速2 μL/min。質(zhì)量軸校準采用甲酸鈉溶液(0.05 mol/L)進行。

1.4 數(shù)據(jù)處理與模式識別

1.4.1 色譜數(shù)據(jù)的提取和前處理 質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理采用Waters公司Markerlynx軟件(Waters，MA，USA)進行色譜峰自動識別和峰匹配，將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P軟件(Umetrics AB，Ume.，Sweden)。采用SIMCA-P軟件先對數(shù)據(jù)進行Mean-centering以及Pareto-scaling處理以減少大面積色譜峰帶來的分析偏差，隨后進行模式識別。兩組間差異用t檢驗分析，p<0.05認為有顯著性差異。

1.4.2 多元統(tǒng)計分析 首先采用無監(jiān)督的PCA方法觀察樣本的聚集及離散狀態(tài)以及離群點。為進一步區(qū)分煙氣暴露組和對照組之間的組間差異，采用有監(jiān)督的PLS-DA判定對于造成這種聚集和離散的主要差異變量，根據(jù)變量權(quán)重值(VIP)找到與吸煙密切相關(guān)的差異表達代謝物。

1.5 差異表達代謝物的鑒定

運用MassLynx軟件中的i-Fit功能，對所篩查到的具有差異的代謝物進行分析，計算其可能的分子式，然后結(jié)合得到的精確質(zhì)量數(shù)，在數(shù)據(jù)庫(如KEGG，http://www.genome.jp；HMDB，http://www.hmdb.ca)中檢索來鑒定標志物，部分標志物用標準品驗證。

圖1 大鼠肺組織典型樣品在負模式(A)和正模式(B)下的質(zhì)譜BPI圖Fig.1 Base peak intensity(BPI) chromatograms of typical sample of rat lung in negative model(A) and positive model(B)

圖2 肺組織QC樣品在負模式下的質(zhì)譜BPI圖Fig.2 Base peak intensity(BPI) chromatogram of QC samples in negative model

2 結(jié)果與討論

2.1 吸煙對大鼠體重的影響

各組大鼠在不同時期的體重變化結(jié)果顯示，兩吸煙組大鼠的體重增長明顯減緩，與對照組相比具有顯著差異；至實驗后期，普通卷煙組的差異更為顯著。這表明吸煙對大鼠體重生長有顯著地抑制作用，普通卷煙抑制作用更顯著。

2.2 生物樣品的UPLC/Q-TOF-MS分析

在分析之前用QC樣本考察了肺組織樣品在質(zhì)譜正、負離子模式下的響應(yīng)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正離子模式下基線本底較高，信息量少；相比正離子模式，負離子模式具有更為豐富的信息(如圖1)，所以本研究采用負離子檢測模式。

用QC樣品考察了樣品的長期穩(wěn)定性，結(jié)果顯示樣品在36 h內(nèi)穩(wěn)定；至48 h，較多物質(zhì)的信號衰減，成分發(fā)生改變，所以處理完的樣品應(yīng)在36 h內(nèi)分析完畢。同時，為了保證分析方法的可靠性，在分析過程中穿插6個QC樣品，從基峰強度(BPI)色譜圖中選取8個典型的色譜峰，統(tǒng)計保留時間(Retention time，tR)和峰強度(Intensity)的變化情況，考察了方法和樣品的穩(wěn)定性，QC樣本的BPI圖見圖2。結(jié)果顯示，各色譜峰的保留時間相對標準偏差(RSD)為0.03%～0.37%，峰強度RSD為3.0%～6.9%，均小于10%，儀器的精密度及化合物的穩(wěn)定性符合代謝組學研究的要求[8]。

2.3 煙氣暴露大鼠代謝組學分析

采用 PCA方法對對照組、普通卷煙組和某品牌天然本草添加卷煙組大鼠肺組織樣本的代謝譜數(shù)據(jù)按不同煙氣暴露時間分別進行模式識別。從結(jié)果來看，雖然對照組與兩卷煙暴露組基本能分開，但組內(nèi)樣品間離散較為嚴重，說明組內(nèi)的個體差異較大，因此進一步采用偏最小二乘判別分析(PLS-DA)對各組樣本進行判別分析。PLS-DA模式識別結(jié)果顯示，各樣品組內(nèi)的聚集情況較好，組間也能得到較好分離，煙氣暴露7 d的大鼠肺組織樣品的模式識別對比結(jié)果見圖3。

圖4 煙氣暴露大鼠不同時期肺組織樣品的PLS-DA分析結(jié)果Fig.4 PLS-DA results for three groups of rats suffering different smoke exposed timesA，B，C are are lung samples of rats smoked for 7，14,30 days, respectively;□:normal control,+:normal tobacco smoked rats,△:certain commercial tobacco smoked rats

將所有樣品用PLS-DA模式進行識別分組，結(jié)果見圖4?？梢钥闯龈鞣谓M織樣品的組內(nèi)聚集情況均較好，各組間均能得到有效分離，對照組與兩吸煙組均有較好的分離，說明吸煙對機體的代謝有一定影響，造成代謝紊亂，但某品牌天然本草添加卷煙與普通卷煙兩組間也具有較好分離，說明兩者對機體的影響有一定的差異。隨著煙氣暴露時間的增長，3組間保持著一定的分離，說明作為煙氣進入體內(nèi)的直接作用器官，肺組織一直受到慢性損傷。

2.4 潛在生物標志物的鑒定

根據(jù)PLS-DA分析中的VIP值，篩選具有明顯差異的化合物，共找到11個具有差異的化合物，結(jié)果如表1所示。

圖5列出了幾種已用標準品鑒定的重要代謝物在對照組大鼠、普通卷煙組大鼠和某品牌天然本草添加卷煙組大鼠肺組織樣本中的相對含量變化。LPC(16∶0)與磷脂代謝有關(guān)，煙氣暴露的兩組大鼠因煙氣的吸入造成磷脂大量降解，暴露30d后，某品牌天然本草添加卷煙降低的程度顯著低于普通卷煙組，說明某品牌天然本草添加卷煙在大鼠磷脂代謝紊亂時，具有一定的保護作用使其受到的損害減少而接近正常組。

本研究經(jīng)多元統(tǒng)計分析篩選得到的標志物中，大多是與磷脂及脂肪酸代謝相關(guān)的標志物。已有文獻報道吸煙會引起磷脂降解[6]，因此體內(nèi)磷脂代謝異?？赡芘c煙氣中氧化性物質(zhì)的吸入對機體細胞膜、脂蛋白、脂質(zhì)等產(chǎn)生影響有關(guān)[6，9-10]，而磷脂代謝的異常會增加心血管疾病的風險[11]，特別是花生四烯酸水平的升高是心血管疾病的重要標志物之一[12]，同時也是機體發(fā)生炎癥反應(yīng)的重要標志物之一[5]，而炎癥的發(fā)生與心血管疾病、癌癥等疾病相關(guān)[13-14]。二十二碳五烯酸是亞麻酸的氧化產(chǎn)物，其水平減少與多種疾病相關(guān)，如冠心病、糖尿病[15]。

表1 潛在差異標志物的鑒定結(jié)果

tR:retention time;↑:up regulated;↓:downregulated，compared with normal control group;*:confirmed with reference substances

圖5 重要標志物在大鼠不同煙氣暴露時期的含量變化趨勢圖

花生四烯酸在體內(nèi)由油酸轉(zhuǎn)化而來，主要以磷脂的形式存在。當機體受到刺激時，花生四烯酸可以轉(zhuǎn)化成前列腺素(PG)，從而發(fā)揮多種生物活性。因此當大鼠受到煙氣刺激時，體內(nèi)產(chǎn)生了大量的花生四烯酸以保護機體?；ㄉ南┧嵩诟鳠煔獗┞督M的水平均有上升，在暴露30 d時顯示出顯著差異，某品牌天然本草添加卷煙組整體水平略低于普通卷煙組，說明某品牌天然本草添加卷煙組大鼠受到的損害相對較小。

亞油酸在磷脂降解時產(chǎn)生，煙氣暴露組的水平高于對照組，但吸食普通卷煙與某品牌天然本草添加卷煙對機體造成的損傷程度有所不同，吸食某品牌卷煙造成的損害相對較小，可能是某品牌天然本草添加卷煙中的天然本草成分高溫裂解后可減少一些自由基等物質(zhì)，從而減少因氧化應(yīng)激造成的磷脂降解[16]。

大鼠在接觸煙氣時產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)從而出現(xiàn)損傷，但總體來講，某品牌天然本草添加卷煙的大鼠損傷程度較低，說明添加有天然本草添加劑的某品牌卷煙對機體有一定保護作用。但目前對于天然本草添加劑在卷煙中的作用機理仍然說法不一。一般認為，當含有天然本草添加劑的卷煙在燃燒時，該本草添加劑經(jīng)揮發(fā)和升華等形成微粒相和氣相成分，該類物質(zhì)可捕獲煙氣中的自由基，降低多環(huán)芳烴類物質(zhì)的生成，同時作用于呼吸系統(tǒng)或被肺泡吸收進入血液，從而對局部或全身起作用，減輕吸煙所引起的不良后果，使機體慢慢恢復(fù)[3]。

從吸食普通卷煙大鼠的肺組織樣本外觀來看，其表面有明顯黑色沉著，特別是顯著異常的樣本，肺組織表面有大量黑色沉著。通過比較該異常樣品與正常樣品的色譜圖(圖6)，可見兩者的主要差異體現(xiàn)在圖中方塊所圈定的部分，通過進一步質(zhì)譜解析(表2)，發(fā)現(xiàn)多個與氧化損傷、炎癥及癌癥相關(guān)的潛在生物標志物。1-羥基芘是煙氣中芘的代謝物，其作為多環(huán)芳烴代表性的致癌標志物多有報道[17]。7-甲基鳥苷是DNA甲基化產(chǎn)物，與癌癥有顯著相關(guān)性，甲基化DNA的產(chǎn)生也可以很好地反映煙氣的氧化應(yīng)激能力[18]。DNA氧化損傷后，若DNA修復(fù)不完全，或修復(fù)基因缺失，會造成染色體畸變和癌基因、抑癌基因突變，最終造成細胞癌變[19]。9,10-二羥基十八碳二烯酸和乙?；?5-甲氧基犬尿氨酸均為氧化損傷的標志物。8-異前列腺素F2a和前列腺素D2均為脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其中8-異前列腺素F2a由花生四烯酸氧化產(chǎn)生，與細胞膜的脂質(zhì)過氧化作用有關(guān)，其水平可以反映機體內(nèi)氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化的水平[20]。(異)前列腺素類物質(zhì)水平的提高也是體內(nèi)炎癥反應(yīng)發(fā)生的信號[21]。因此，可以看出該大鼠的肺組織因煙氣暴露而受到了嚴重的氧化損傷，出現(xiàn)了炎癥反應(yīng)，并出現(xiàn)了與癌癥相關(guān)的生物標志物。在含有天然本草添加劑的某品牌卷煙煙氣暴露組大鼠的肺組織樣本中未找到癌癥相關(guān)的標志物，但長期吸食造成的磷脂代謝、脂肪酸代謝紊亂仍然會對機體造成慢性損傷，該結(jié)果與美國健康研究所的研究結(jié)果相符，他們在大量流行病學研究結(jié)果基礎(chǔ)上得出的結(jié)論認為與未用過濾嘴或高焦油卷煙的煙民相比，吸用濾嘴或低焦油煙得肺癌和心臟病的發(fā)病率有顯著差異，但是慢性肺部疾病無顯著差異性[22]。

本實驗中普通卷煙暴露組的大鼠共有30只，有2只出現(xiàn)嚴重的氧化損傷，這說明不同個體對于煙草中致癌物的敏感性有所不同，該結(jié)果也符合流行病學統(tǒng)計數(shù)據(jù)。據(jù)統(tǒng)計，盡管有80%～90%的肺癌與煙草暴露有關(guān)，但吸煙者中只有少于20%的人發(fā)展成為肺癌[23]。

圖6 煙氣暴露第14 d對照組正常肺組織樣品(A)，某品牌卷煙組肺組織樣品(B)和普通煙組異常肺組織樣品(C)的質(zhì)譜負模式BPI圖Fig.6 Base peak intensity(BPI) chromatograms of lung sample of normal control group(A)，lung sample from a certain commercial tobacco(a specific tobacco with herbal additives) group(B) and abnormal lung sample from normal tobacco group(C) at 14 d exposed to smoke

表2 異常肺組織樣品重要標志物的鑒定結(jié)果

3 結(jié) 論

本文運用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)并結(jié)合PLS-DA模式識別分析方法研究了不同煙氣暴露時期正常大鼠、普通卷煙組和某品牌天然本草添加卷煙組大鼠肺組織的代謝譜。結(jié)果表明，普通卷煙和某品牌天然本草添加卷煙均會對大鼠的肺組織造成損傷，特別是長期暴露會造成磷脂代謝、脂肪酸代謝等紊亂，但總體來說，天然本草添加卷煙對大鼠的損傷程度低于普通卷煙。目前天然本草添加劑中改善煙氣對體內(nèi)代謝的影響的物質(zhì)基礎(chǔ)仍然未知，其作用機制的闡明有待后續(xù)的進一步研究。

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Lung Metabolome Research of Rats Exposed to Tobacco Smoke with Herbal Additives by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

SU Jia-kun1，YING Xu-hui3，LUO Juan-min1,WANG Yi-ming2*,XU Da1,LUO Guo-an3，CAI Ji-bao1*

(1.Tobacco Jiangxi Industrial Co.，Ltd.，Nanchang 330096，China;2.Zhuhai Qingda Hongrui Biotechnology Co.，Ltd.，Zhuhai 519085，China;3.Department of Chemsitry，Tsinghua University，Beijing 100084，China)

The effect of tobacco with herbal additives on the global metabolome of rat lung was studied using liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS).Lung samples from control rats，normal tobacco smoked rats and a certain commercial tobacco(a specific tobacco with herbal additives)smoked rats were analyzed，and the groups were exposed to smoke for one week，half month and one month，respectively.The data were processed by the method of partial least squares discriminant analysis(PLS-DA).The potential biomarkers were screened out according to VIP(Variable Importance in the Projection) and identified by database and standards.The PLS-DA results of different tobacco exposed periods showed that the metabolism of both the normal tobacco exposed group and the certain commercial tobacco exposed group were affected，mainly including phospholipid metabolism and fatty acid metabolism.In particular，two lung samples from rats exposed to normal tobacco were abnormal significantly as a result of suffering from a serious oxidative damage.Overall，especially prolonged exposure to smoke，the smoke damage of the certain commercial tobacco smoked rats was lower than that of the normal tobacco smoked rats，indicating that adding some herbal additives to tobacco could contribute at least partly to reduce the harm caused by smoking.

liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS);metabonomics;tobacco with herbal additives;lung;biomarker

2016-04-05；

2016-06-29

中國煙草總公司重大專項項目(110201401025(JH-03))

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.12.002

O657.72;TS452.4

A

1004-4957(2016)12-1521-07

*通訊作者：蔡繼寶，研究員，研究方向：煙草化學，Tel:0791-88286946，E-mail：jbcai@ustc.edu.cn 王義明，教授，研究方向：生命分析化學，Tel:010-62781688，E-mail：wangyiming1688@163.com