Ali Faheem，李光兵，劉軍

(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院，濟(jì)南250021)

肝癌組織中LUZP表達(dá)變化及其與患者臨床病理特征的關(guān)系

Ali Faheem，李光兵，劉軍

(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院，濟(jì)南250021)

目的 探討亮氨酸拉鏈蛋白(LUZP)表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系。方法 選擇接受手術(shù)治療的77例肝癌患者的肝癌及癌旁肝組織，采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)癌及癌旁肝組織中LUZP mRNA的表達(dá)，采用免疫組化法檢測(cè)癌及癌旁肝組織中LUZP蛋白的表達(dá)，半定量計(jì)分法對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以癌旁肝組織LUZP mRNA均值為標(biāo)準(zhǔn)，將肝癌患者分為LUZP 高表達(dá)、低表達(dá)兩個(gè)水平，比較不同LUZP表達(dá)水平患者的臨床病理特征。結(jié)果 肝癌與癌旁肝組織LUZP mRNA表達(dá)分別為1.87±0.11、0.58±0.05，肝癌組織中LUZP mRNA表達(dá)高于癌旁肝組織(P<0.05)。肝癌與癌旁肝組織LUZP蛋白表達(dá)分別為(10.0±1.5)、(4.0±0.5)分，肝癌組織中LUZP蛋白表達(dá)高于癌旁肝組織(P<0.05)。以癌旁肝組織LUZP mRNA均值為標(biāo)準(zhǔn)，將肝癌患者分為LUZP 高表達(dá)49例、低表達(dá)28例。LUZP高表達(dá)患者侵犯門靜脈、TNM 1+2期、復(fù)發(fā)的發(fā)生率均高于低表達(dá)患者(P均<0.05)。低表達(dá)患者的總生存時(shí)間是36個(gè)月，高表達(dá)患者的總生存時(shí)間是12個(gè)月，LUZP高表達(dá)患者的生存時(shí)間低于低表達(dá)患者(P<0.05，OR=1.88, 95%CI為1.08～3.30)。結(jié)論 LUZP是肝癌患者預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)，其高表達(dá)提示肝癌患者預(yù)后差。

肝細(xì)胞癌；亮氨酸拉鏈蛋白；預(yù)后

肝癌是發(fā)病率第五位的惡性腫瘤，是世界上第三位的導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的疾病[1]。目前手術(shù)是治療肝癌惟一的治愈方法。但是多數(shù)肝癌患者就診時(shí)已處于腫瘤晚期，手術(shù)治療后腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)易導(dǎo)致手術(shù)治療效果差[2]。降低肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)率、提高患者預(yù)后是目前肝癌治療領(lǐng)域的主要難點(diǎn)之一。亮氨酸拉鏈蛋白(LUZP)是一種含有亮氨酸拉鏈基序的蛋白質(zhì)[3]，在正常發(fā)育中起到重要的調(diào)控作用，其表達(dá)缺失將導(dǎo)致胚胎出顱神經(jīng)管的閉合缺損[4]。研究發(fā)現(xiàn)，LUZP的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，在乳腺癌、腎癌、宮頸癌和胰腺癌等腫瘤組織中均檢測(cè)到LUZP的過度表達(dá)，且其表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)[5～7]。目前對(duì)肝癌組織中LUZP的表達(dá)情況尚不明確。我們選擇2010年9月～2012年1月行手術(shù)治療的77例肝癌患者，對(duì)其癌組織中LUZP的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，探討LUZP的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇同期在我院接受手術(shù)治療的77例肝癌患者的肝癌及癌旁肝組織，男67例、女10例，年齡24～73歲、中位年齡48.5歲。均經(jīng)病理學(xué)檢查確診。均無丙型肝炎病毒感染和黃曲霉素接觸史。收集患者臨床病理特征數(shù)據(jù)，包括年齡、性別、甲胎蛋白水平、腫瘤大小、門靜脈侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、酒精攝入量、肝癌TNM分期、肝癌家族史、復(fù)發(fā)、乙肝病毒感染狀況、丙肝病毒感染情況、黃曲霉毒素接觸史和生存時(shí)間。

1.2 LUZP mRNA表達(dá)檢測(cè) 將癌及癌旁肝組織分割后液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱。應(yīng)用Allprep DNA/RNA抽提試劑盒提取組織總RNA，應(yīng)用去DNA試劑盒去除RNA標(biāo)本中的基因組DNA。ND-2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。取1 μg總RNA為模板，應(yīng)用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)癌及癌旁肝組織中LUZP mRNA的表達(dá)。引物序列：LUZP 正向5′-CGGAAGTATTGACGGAAAGC-3′，反向5′-GCTTGTAAATTCG-GCCATGT-3′，產(chǎn)物長度237 bp；β-Actin正向5′-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3′，反向5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′。qPCR反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s 40個(gè)循環(huán)。用2%瓊脂糖凝膠對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離并用EB染色。以2-ΔΔCt法分析結(jié)果。

1.3 LUZP蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法。取癌及癌旁肝組織制備石蠟切片，脫蠟后梯度酒精水化，0.1 mmol/L枸櫞酸鈉行抗原修復(fù)。利用兔抗人LUZP多克隆抗體一抗孵育切片，應(yīng)用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的鼠抗兔二抗進(jìn)行顯影。顯微鏡下計(jì)數(shù)陽性染色細(xì)胞數(shù)。半定量法評(píng)分法對(duì)LUZP陽性率進(jìn)行分析。染色強(qiáng)度評(píng)分為：1分為無陽性染色；2分為無陽性染色；3分為中度陽性染色；4分為強(qiáng)陽性染色。陽性細(xì)胞百分比評(píng)分：0分為無陽性細(xì)胞；1分為陽性細(xì)胞數(shù)<10%；2分為陽性細(xì)胞數(shù)10%～50%；3分為陽性細(xì)胞數(shù)51%～80%；4分為陽性細(xì)胞數(shù)>80%。以染色強(qiáng)度評(píng)分與百分比評(píng)分乘積計(jì)為半定量評(píng)分分?jǐn)?shù)。

1.4 隨訪方法 所有患者隨訪至死亡或隨訪至2016年6月，記錄生存時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 肝癌與癌旁肝組織中LUZPmRNA表達(dá)比較 肝癌與癌旁肝組織LUZPmRNA表達(dá)分別為1.87±0.11、0.58±0.05，肝癌組織中LUZPmRNA表達(dá)高于癌旁肝組織(P<0.05)。以癌旁肝組織LUZPmRNA均值為標(biāo)準(zhǔn)，將肝癌患者分為LUZP高表達(dá)49例、低表達(dá)28例。

2.2 肝癌與癌旁肝組織中LUZP蛋白表達(dá)比較 免疫組化法對(duì)肝癌與癌旁肝組織中LUZP蛋白進(jìn)行檢測(cè)，半定量法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，肝癌與癌旁肝組織中LUZP蛋白表達(dá)分別為(10.0±1.5)、(4.0±0.5)分，肝癌組織中LUZP蛋白表達(dá)高于癌旁肝組織(P<0.05)。

2.3LUZPmRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系LUZP高表達(dá)患者侵犯門靜脈、TNM1+2期、復(fù)發(fā)的發(fā)生率均高于低表達(dá)患者(P均<0.05)。LUZP高表達(dá)與低表達(dá)患者在年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、乙肝病毒感染、甲胎蛋白水平、腫瘤直徑、腫瘤史和酒精攝入量方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表1。

2.4LUZPmRNA水平與肝癌患者預(yù)后相關(guān)性 所有患者均隨訪至患者死亡或2016年6月，所有死亡患者死亡原因均為肝癌復(fù)發(fā)。低表達(dá)患者的總生存時(shí)間是36個(gè)月，高表達(dá)患者的總生存時(shí)間是12個(gè)月，LUZP高表達(dá)患者的生存時(shí)間低于低表達(dá)患者(P均<0.05，OR=1.88, 95% CI為1.08～3.30)。

表1 不同LUZP表達(dá)水平患者的臨床病理特征(例)

3 討論

肝癌是在慢性肝臟疾病如慢性肝炎、酒精性肝炎等基礎(chǔ)上發(fā)展而來的[8,9]，乙肝病毒、丙肝病毒感染等肝癌發(fā)病的危險(xiǎn)因素會(huì)誘導(dǎo)原癌基因過度活化或抑癌基因失活，從而導(dǎo)致肝癌的發(fā)生、發(fā)展[10]。肝癌發(fā)病隱匿、進(jìn)展迅速，70%～80%病例發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，如合并門靜脈癌栓、肝外轉(zhuǎn)移等，若不進(jìn)行有效干預(yù)，患者短期內(nèi)可能出現(xiàn)死亡。手術(shù)是目前治療肝癌最有效的手段[11]。但手術(shù)治療后腫瘤復(fù)發(fā)率高，肝癌患者術(shù)后的5年生存率低于20%[12]。研究與肝癌復(fù)發(fā)相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物,有助于制定合理的治療方案、改善患者預(yù)后、提高患者生存時(shí)間。

LUZP是一種調(diào)節(jié)蛋白，含有一個(gè)20種氨基酸的片段，富含有氨基酸殘基的堿基端拉鏈基序的側(cè)邊區(qū)域、包括堿性區(qū)域、亮氨酸殘基的周期排列被稱為“堿性亮氨酸拉鏈基序”或亞模體(亞超二級(jí)結(jié)構(gòu))[13]。這個(gè)堿性區(qū)域被認(rèn)為是通過與帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)的DNA相互作用來促進(jìn)DNA間的結(jié)合，參與基因表達(dá)的調(diào)控。LUZP過度表達(dá)或突變都可能導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生，在宮頸癌、乳腺癌、胰腺癌等實(shí)體腫瘤中均可檢測(cè)到LUZP的異常表達(dá)[5, 7]。本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中LUZP mRNA及蛋白表達(dá)均高于癌旁肝組織，提示LUZP的異常表達(dá)可能上調(diào)癌基因或下調(diào)抑癌基因的表達(dá)，誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，LUZP高表達(dá)患者的生存時(shí)間低于低表達(dá)患者，提示LUZP mRNA高表達(dá)預(yù)示著患者生存時(shí)間短。

文獻(xiàn)報(bào)道，胰腺癌、乳腺癌和宮頸癌患者LUZP的過度表達(dá)提示患者預(yù)后不良[13]。LUZP表達(dá)升高能夠抑制胰腺癌細(xì)胞的凋亡，降低胰腺癌細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性，降低胰腺癌患者5年生存率[14]。Jang等[5]研究顯示，LUZP表達(dá)升高會(huì)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，高表達(dá)LUZP的乳腺癌患者治療后容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者長期生存率顯著下降。Kang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，LUZP表達(dá)升高同樣能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，降低患者預(yù)后。本研究發(fā)現(xiàn)，在門靜脈侵犯率、腫瘤分期以及復(fù)發(fā)率方面，LUZP mRNA高表達(dá)組與低表達(dá)組患者存在顯著差異，高表達(dá)組患者在診斷時(shí)更多處于腫瘤晚期、合并門靜脈侵犯，治療后復(fù)發(fā)率顯著高于低表達(dá)組患者，這與高表達(dá)組患者預(yù)后比低表達(dá)組患者差的結(jié)果一致，也提示LUZP的異常高表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。

本研究發(fā)現(xiàn)，LUZP mRNA高表達(dá)組與低表達(dá)組患者在淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑以及甲胎蛋白水平方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。文獻(xiàn)研究顯示，甲胎蛋白水平與肝癌患者預(yù)后相關(guān)，甲胎蛋白水平升高提示患者預(yù)后差。而大肝癌或巨大肝癌患者預(yù)后比小肝癌患者預(yù)后差。本研究結(jié)果未能證實(shí)LUZP表達(dá)與腫瘤大小以及甲胎蛋白水平間的相關(guān)性，可能與本研究樣本量小有關(guān)，因此需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

綜上所述，LUZP在肝癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁肝組織，提示其異常高表達(dá)會(huì)促進(jìn)肝癌的發(fā)生、發(fā)展,其表達(dá)升高提示肝癌患者預(yù)后差。本研究結(jié)果為LUZP作為肝癌預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)以及作為肝癌治療靶點(diǎn)蛋白提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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劉軍(E-mail: Dr_liujun1967@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.46.018

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B

1002-266X(2016)46-0062-03

2016-05-21)