劉浩，陳衛(wèi)剛，鄭勇

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子832008)

硫氫化鈉對(duì)肝硬化大鼠肝細(xì)胞凋亡及肝組織Bax、Bcl-2表達(dá)的影響

劉浩，陳衛(wèi)剛，鄭勇

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子832008)

目的 探討硫氫化鈉(NaHS)對(duì)肝硬化大鼠的肝保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 選擇雌性SD大鼠40只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、肝硬化組、炔丙基甘氨酸(PPG)組、NaHS組，每組10只。肝硬化組、PPG組、NaHS組采用四氯化碳復(fù)合因素法制備肝硬化模型。PPG組腹腔注射PPG 30 mg/(kg·d)，NaHS組腹腔注射N(xiāo)aHS 56 μmol/(kg·d)，正常對(duì)照組和肝硬化組腹腔注射等量生理鹽水，共注射7天。末次注射次日處死大鼠，留取肝組織，免疫組化法檢測(cè)肝組織Bax、Bcl-2表達(dá),脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)缺口末端標(biāo)記法測(cè)定肝細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)。結(jié)果 肝組織Bax、Bcl-2蛋白均定位于細(xì)胞質(zhì)，染色后呈棕黃色顆粒狀，凋亡肝細(xì)胞細(xì)胞核呈棕黃色或黃褐色。與正常對(duì)照組比較，肝硬化組AI明顯升高(P<0.05)；與肝硬化組比較，NaHS組Bax表達(dá)及AI均明顯降低(P均<0.05)，PPG組Bax表達(dá)及AI均明顯升高(P均<0.05)；各組間Bcl-2表達(dá)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 NaHS對(duì)肝硬化大鼠具有肝保護(hù)作用，可抑制肝細(xì)胞凋亡；其機(jī)制可能與下調(diào)Bax表達(dá)有關(guān)。

肝硬化；硫氫化鈉；硫化氫；細(xì)胞凋亡；Bax；Bcl-2

硫化氫(H2S)是繼NO、CO之后發(fā)現(xiàn)的第三種新型氣體信號(hào)分子，在體內(nèi)主要通過(guò)細(xì)胞胱硫醚β合成酶(CBS)、細(xì)胞胱硫醚γ裂解酶(CSE)催化L-半胱氨酸而產(chǎn)生，具有擴(kuò)張血管、心肌保護(hù)、抗炎等作用[1～4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，其在肝纖維化及門(mén)脈高壓的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要作用[5～9]。本課題前期研究證實(shí)，腹腔注射硫氫化鈉(NaHS)可改變大鼠體內(nèi)H2S的含量。2013年6月～2014年1月，我們觀察了NaHS對(duì)肝硬化大鼠肝細(xì)胞凋亡及肝組織Bax、Bcl-2表達(dá)的影響，現(xiàn)分析結(jié)果，探討NaHS在肝硬化發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 健康、SPF級(jí)、雌性SD大鼠40只，體質(zhì)量(210±10)g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，為同期出生的純種系。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25 ℃，濕度50%左右。主要儀器：RM2135型石蠟切片機(jī)，德國(guó)LEICA公司；免疫組化圖像分析系統(tǒng)，日本OLYMPUS株式會(huì)社。主要試劑：兔抗鼠Bcl-2多克隆一抗，英國(guó)Abcam公司；兔抗鼠Bax多克隆一抗，武漢博士德生物工程有限公司；脫氫核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)缺口端標(biāo)記(TUNEL)試劑盒，瑞士Roche公司；二抗檢測(cè)試劑盒，北京中杉金橋有限責(zé)任公司；硫氫化鈉(NaHS)、炔丙基甘氨酸(PPG)，美國(guó)Sigma公司；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 模型制備及干預(yù) 將40只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、肝硬化組、PPG組、NaHS組，每組10只。肝硬化組、PPG組、NaHS組采用四氯化碳復(fù)合因素法制備肝硬化模型：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，皮下注射40%四氯化碳植物油溶液，首次劑量為0.5 mL/100 g，以后每隔4天注射1次，劑量為0.3 mL/100 g，共注射13次。造模期間各組以30%乙醇溶液作為惟一飲用液體；前2周用20%豬油+80%玉米面飼養(yǎng)，之后用0.5%膽固醇粉+玉米面飼養(yǎng)至造模結(jié)束。正常對(duì)照組同期皮下注射等量生理鹽水，喂養(yǎng)飼料為復(fù)合飼料，飲用水為自來(lái)水。52天后處死大鼠，肝硬化組、PPG組、NaHS組均造模成功。造模結(jié)束PPG組腹腔注射PPG 30 mg/(kg·d)，NaHS組腹腔注射N(xiāo)aHS 56 μmol/(kg·d)，正常對(duì)照組、肝硬化組同期腹腔注射等量生理鹽水，共注射7天。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 肝組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) 采用免疫組化法。末次注射次日采用頸椎脫臼法處死大鼠，取部分肝組織置于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，4 μm厚切片。切片常規(guī)脫蠟至水，3%雙氧水甲醇中浸泡10 min。枸櫞酸修復(fù)液微波爐中高火修復(fù)至冒泡后再低火修復(fù)20 min，冷卻至室溫，加Bax、Bcl-2一抗，置于4 ℃冰箱過(guò)夜。次日PBS沖洗5 min×3次，滴加二抗(兩步法)，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性部位在細(xì)胞質(zhì)，顯棕黃色。每張標(biāo)本切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野區(qū)域，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)率。陽(yáng)性表達(dá)率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.2 肝細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI) 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%雙氧水甲醇中浸泡10 min，PBS沖洗5 min×3次；蛋白酶K(15 μg/mL)37 ℃溫箱中孵育7 min；20%胎牛血清室溫下封閉20 min；用濾紙吸去殘留液后滴加反應(yīng)液50 μL(TdT 3 μL，熒光素連接的核苷酸混合緩沖液47 μL，陰性對(duì)照片不加TdT)，37 ℃溫箱中孵育45 min，PBS沖洗5 min×3；20%山羊血清室溫下封閉20 min，加POD轉(zhuǎn)換劑(原液1∶2稀釋)，置于37 ℃溫箱中孵育30 min，顯微鏡下DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。陽(yáng)性部位在細(xì)胞核，顯棕黃色或棕褐色。計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡視野下100個(gè)肝細(xì)胞核中陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù)，取其均值為AI。

2 結(jié)果

各組肝組織Bax、Bcl-2蛋白均定位于細(xì)胞質(zhì)，染色后呈顆粒狀棕黃色。見(jiàn)插頁(yè)Ⅰ圖4、5。與正常對(duì)照組比較，肝硬化組AI明顯升高(P<0.05)；與肝硬化組比較，NaHS組Bax表達(dá)及AI均明顯降低(P均<0.05)，PPG組Bax表達(dá)及AI均明顯升高(P均<0.05)；各組間Bcl-2表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組肝細(xì)胞AI及肝組織Bax、Bcl-2陽(yáng)性率比較

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與肝硬化組比較，#P<0.05。

3 討論

腹腔注射N(xiāo)aHS可改變體內(nèi)H2S含量。早期研究發(fā)現(xiàn)，H2S是一種存在于腦內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)海馬的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)功能具有調(diào)節(jié)作用；隨著研究的深入，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其對(duì)自發(fā)性高血壓、阿爾茨海默病及肝硬化等疾病均具有調(diào)節(jié)作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，H2S在肝硬化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中及調(diào)節(jié)門(mén)靜脈壓力方面發(fā)揮重要的保護(hù)性作用[5～10]。有報(bào)道顯示，H2S作為第三種氣體信號(hào)分子與NO、CO氣體信號(hào)分子存在相互作用[11]。

肝細(xì)胞凋亡是肝臟疾病最重要的發(fā)病原因之一，在正常肝臟發(fā)育及多種肝臟疾病的發(fā)生過(guò)程中具有重要作用[12，13]。肝臟在受到損傷因素，如病毒感染、酒精刺激等作用時(shí)，原本存在于體內(nèi)的肝細(xì)胞死亡程序可能被激活，進(jìn)而引起肝細(xì)胞的程序性死亡(凋亡)，并產(chǎn)生大量的凋亡小體。凋亡小體被肝臟中主要吞噬細(xì)胞-枯否細(xì)胞吞噬后產(chǎn)生大量的促炎癥因子和凋亡受體，可進(jìn)一步促進(jìn)肝細(xì)胞的凋亡并能引發(fā)炎癥反應(yīng)；凋亡小體還可通過(guò)以下途徑激活肝星狀細(xì)胞：①直接刺激肝星狀細(xì)胞的激活；②刺激枯否細(xì)胞活化而間接刺激肝星狀細(xì)胞的活化；③刺激MMP-2/9活性而間接刺激肝星狀細(xì)胞活化；活化后的肝星狀細(xì)胞可產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)及膠原蛋白，最終導(dǎo)致肝纖維化的形成。因此認(rèn)為，肝細(xì)胞病理性凋亡和肝纖維化發(fā)生密切相關(guān)，病理性肝細(xì)胞凋亡啟動(dòng)并促進(jìn)了肝纖維化的發(fā)生。

Bcl-2家族是目前研究較多的凋亡相關(guān)基因，其家族成員包括兩類(lèi)：一類(lèi)是凋亡促進(jìn)基因，包括Bax、Bad、Bak等；另一類(lèi)是以Bcl-2為代表的凋亡抑制基因。Bcl-2蛋白主要分布在線(xiàn)粒體外膜、細(xì)胞膜內(nèi)表面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜及核膜等。Bax的表達(dá)更為廣泛，可出現(xiàn)在肝細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等。研究發(fā)現(xiàn)，Bax與Bcl-2的比例(Bax/Bcl-2)關(guān)系是決定其對(duì)細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素。有研究表明，H2S可通過(guò)影響B(tài)ax的表達(dá)發(fā)揮其對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)性作用[14]；H2S在肝臟缺血再灌注損傷時(shí)通過(guò)抑制肝細(xì)胞凋亡發(fā)揮其保護(hù)性作用[15]。本研究結(jié)果顯示，各組肝組織中均有Bax、Bcl-2表達(dá)，但Bax陽(yáng)性率遠(yuǎn)高于Bcl-2，表明Bcl-2在肝臟中表達(dá)較少，甚至有研究認(rèn)為其在肝組織中無(wú)表達(dá)。與肝硬化組比較，NaHS組Bax表達(dá)明顯降低，PPG組Bax表達(dá)明顯升高；各組間Bcl-2表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，肝硬化組肝細(xì)胞凋亡增加，NaHS組肝細(xì)胞凋亡減少，PPG組肝細(xì)胞凋亡增加。與正常對(duì)照組比較，肝硬化組AI明顯升高；與肝硬化組比較，NaHS組AI明顯降低，PPG組AI明顯升高；進(jìn)一步證實(shí)了上述觀點(diǎn)。

綜上所述，NaHS在大鼠肝硬化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有保護(hù)性作用，其作用機(jī)制可能為下調(diào)Bax表達(dá)。

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國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81170402)。

鄭勇(E-mail： zy2850@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.44.012

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A

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2015-11-30)