湯小軍，黃仁彬，盧庭婷，黃建春

(1廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，南寧530021；2 廣西醫(yī)科大學(xué))

六月青多糖對(duì)S180肉瘤細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制

湯小軍1，黃仁彬2，盧庭婷1，黃建春2

(1廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，南寧530021；2 廣西醫(yī)科大學(xué))

目的 探討六月青多糖對(duì)S180肉瘤細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制。方法 取SPF級(jí)昆明種小鼠48只，腹腔注射S180肉瘤細(xì)胞株，注射第8天時(shí)抽取腹水，分離細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板；隨機(jī)分為對(duì)照組、六月青多糖組。六月青多糖組加入適量六月青多糖，使其終濃度分別為4、2、1、0.5、0.25、0.125 g/L；對(duì)照組加入等量生理鹽水。分別于培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)采用MTT法檢測(cè)各孔光密度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。另取小鼠36只腹腔注射S180肉瘤細(xì)胞株，7 天后抽取腹水，分離癌細(xì)胞，將癌細(xì)胞懸液分別接種于小鼠右側(cè)腋窩皮下，接種第11天時(shí)處死荷瘤小鼠，抽取腹腔積液并取脾臟，分離培養(yǎng)腹腔巨噬細(xì)胞及脾淋巴細(xì)胞，隨機(jī)分為兩組。六月青多糖組分別加入終濃度為200、100、50 μg/mL的六月青多糖；對(duì)照組加入等量生理鹽水；培養(yǎng)24 h時(shí)采用ELISA試劑盒檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6水平及脾淋巴細(xì)胞IL-2、IFN-γ水平。結(jié)果 同時(shí)間點(diǎn)六月青多糖組細(xì)胞增殖抑制率隨濃度增加而升高(P均<0.05)，同濃度下六月青多糖組細(xì)胞增殖抑制率隨作用時(shí)間延長而升高(P均<0.05)。與對(duì)照組比較，200、100、50 μg/mL六月青多糖組腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α水平逐漸降低(P<0.05或<0.01)；與對(duì)照組比較，100、200 μg/mL六月青多糖組腹腔巨噬細(xì)胞IL-6水平均增加，脾淋巴細(xì)胞IL-2、IFN-γ水平均增加(P<0.05或<0.01)。結(jié)論 六月青多糖體外對(duì)S180細(xì)胞增殖具有抑制作用，其機(jī)制可能為促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6和脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ。

肉瘤；六月青多糖；腹腔巨噬細(xì)胞；脾淋巴細(xì)胞；炎癥因子

廣西民間草藥六月青是爵床科植物肖雞籠(頂頭馬蘭)的地上干燥部分，六月青多糖是其主要成分。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，六月青多糖能抑制S180荷瘤小鼠腫瘤生長，增強(qiáng)免疫功能、抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡可能是其作用機(jī)制[1,2]。但六月青多糖在體外對(duì)S180肉瘤細(xì)胞的作用及其機(jī)制未見報(bào)道。2014年6月～2015年8月，本研究觀察了六月青多糖在體外對(duì)S180肉瘤細(xì)胞增殖的影響，現(xiàn)分析結(jié)果，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠肉瘤細(xì)胞株S180購自廣西中醫(yī)藥研究院。SPF級(jí)昆明種小鼠120只，體質(zhì)量(20.0±2.0)g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(桂)2009-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK(桂)2009-0004。六月青多糖由廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供，純度為99%；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；小鼠TNF-α、IL-6、IL-2和IFN-γ ELISA試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 六月青多糖干預(yù)及細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè) 取小鼠48只，均腹腔注射S180肉瘤細(xì)胞株，注射第8天時(shí)抽取腹水，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS液和RPMI 1640培養(yǎng)液各洗兩次。調(diào)整細(xì)胞密度為1×108個(gè)/L，接種到96孔培養(yǎng)板，180 μL/孔。隨機(jī)分為兩組，六月青多糖組分別加入適量六月青多糖，使其終濃度為4、2、1、0.5、0.25、0.125 g/L(20 μL/孔)；對(duì)照組加入等量生理鹽水。各組均置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，分別加入200 μL DMSO，振蕩10 min，檢測(cè)492 nm處各孔光密度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)[3]=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.2.2 六月青多糖干預(yù)及腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6檢測(cè) 取小鼠36只，腹腔注射S180肉瘤細(xì)胞株，7 天后抽取腹水，用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞密度為1×1010個(gè)/L，將癌細(xì)胞懸液分別接種于另外36只小鼠右側(cè)腋窩皮下，0.2 mL/只。接種第11天時(shí)處死，向其腹腔注入4 ℃的RPMI 1640培養(yǎng)液5 mL，揉腹部1 min后抽取腹腔積液，1 500 r/min離心5 min；RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1×1010個(gè)/L，接種至96孔培養(yǎng)板，100 μL/孔；37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，棄上清液，PBS洗3次，棄非黏附細(xì)胞；在貼壁的細(xì)胞中加入RPMI 1640培養(yǎng)液100 μL/孔，經(jīng)倒置相差顯微鏡觀察和HE染色觀察貼壁細(xì)胞為巨噬細(xì)胞[4]。隨機(jī)分為兩組，六月青多糖組分別加入適量六月青多糖，使其終濃度為200、100、50 μg/mL；對(duì)照組加入等量生理鹽水。兩組均置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h時(shí)于4 ℃條件下1 000 r/min離心10 min，收集上清液，采用ELISA試劑盒檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6水平，步驟均參照試劑盒說明書。

1.2.3 六月青多糖干預(yù)及脾淋巴細(xì)胞IL-2、IFN-γ檢測(cè) 取1.2.2中處死的S180荷瘤小鼠，無菌條件下取脾臟，用D-Hank′s液洗后剪碎，過200目篩，1 500 r/min離心10 min，沉淀液中加入2 mL D-Hank′s液，用小鼠淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為5×106個(gè)/mL[5]，臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活力>95%。隨機(jī)分組，分組方法及處理同1.2.2，各組均置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h時(shí)于4 ℃條件下1 000 r/min離心10 min，收集上清液，采用ELISA試劑盒檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞IL-2、IFN-γ水平，步驟均參照試劑盒說明書。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較 同時(shí)間點(diǎn)六月青多糖組細(xì)胞增殖抑制率隨濃度增加而升高(P均<0.05)，同濃度下六月青多糖組細(xì)胞增殖抑制率隨作用時(shí)間延長而升高(P均<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率

2.2 各組腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6水平和脾淋巴細(xì)胞IL-2、IFN-γ水平比較 與對(duì)照組比較，六月青多糖組各劑量作用后腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α水平均升高(P<0.05或<0.01)。與50 μg/mL六月青多糖組比較，100、200 μg/mL六月青多糖組腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α水平均升高(P均<0.05)，200 μg/mL六月青多糖組腹腔巨噬細(xì)胞IL-6水平升高、脾淋巴細(xì)胞IFN-γ水平升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6水平和脾淋巴細(xì)胞IL-2、IFN-γ水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，#P<0.01；與50 μg/mL六月青多糖組比較，△P<0.05。

3 討論

目前腫瘤治療主要采用化療、放療、手術(shù)和生物治療等綜合措施，臨床應(yīng)用最廣泛的抗腫瘤西藥有金屬鉑類、抗代謝類、烷化劑等，但均具有干擾免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等毒副作用。與抗腫瘤西藥相比，中草藥抗腫瘤治療具有多層次、多通路、多目標(biāo)、多成分的特點(diǎn)，我國已對(duì)藥用植物中28個(gè)科(屬)3 000多種藥用植物進(jìn)行了抗腫瘤作用篩選，發(fā)現(xiàn)200多種植物中含有抗腫瘤活性成分，主要包括蛋白質(zhì)類、多糖類、蟾蜍甾二烯類、萜類、黃酮類、生物堿類、苷類等[6～9]。中藥中的多糖成分是目前抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)，其抗腫瘤作用顯著且毒副作用小。多糖成分抗腫瘤的主要機(jī)制為：①中藥多糖通過激活T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞因子和抗體生成，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[10]；②通過影響腫瘤細(xì)胞的生長、分裂、增殖等多個(gè)環(huán)節(jié)實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤生長的抑制。目前，靈芝、人參、香菇、銀耳、蘆薈等中藥(主要成分均為多糖)作為抗腫瘤藥物或輔助藥物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床[11,12]。

《本草拾遺》記載，六月青能涼血、活血、疏肝利濕、消腫止痛，主要用于急慢性肝炎、黃疸、高血壓等治療。前期研究發(fā)現(xiàn)，六月青的主要活性成分是六月青多糖和皂苷，兩種成分均能抑制乙肝病毒的復(fù)制、保護(hù)肝細(xì)胞，對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化均有預(yù)防和治療作用。此外，六月青石油醚部位和60%乙醇部位均能抑制胃癌細(xì)胞SGC7901、MGC803和乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、口腔表皮樣癌細(xì)胞KB的生長，對(duì)小鼠免疫功能有明顯的增強(qiáng)作用[13]；六月青多糖可通過增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞Bax和Bcl-2基因表達(dá)，進(jìn)而抑制小鼠S180腫瘤生長[1,2]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，0.125、0.25、0.5、1、2、4 g/L六月青多糖作用24、48、72 h均可抑制S180細(xì)胞增殖，且具有濃度和時(shí)間依賴性。

腫瘤發(fā)生的原因之一是患者免疫系統(tǒng)功能低下導(dǎo)致免疫監(jiān)視無能，腫瘤患者的免疫功能由早期的活躍狀態(tài)演變?yōu)橹泻笃诘囊种茽顟B(tài)，免疫狀態(tài)與病情呈負(fù)相關(guān)，因此腫瘤的治療措施之一是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[14]。機(jī)體免疫應(yīng)答主要有細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答，其中細(xì)胞免疫應(yīng)答在抗腫瘤免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用，參與抗腫瘤細(xì)胞免疫的細(xì)胞主要有T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等，這些細(xì)胞被激活后通過分泌細(xì)胞因子發(fā)揮抗腫瘤作用，如激活的T淋巴細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子，增強(qiáng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的效應(yīng)；活化的巨噬細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子，激活B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)[15～17]。本研究結(jié)果顯示，100、200 μg/mL六月青多糖均可促進(jìn)S180荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6和脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ，提示六月青多糖可能通過刺激巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上所述，六月青多糖可抑制體外S180肉瘤細(xì)胞增殖，刺激巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-6、IL-2、IFN-γ可能是其作用機(jī)制，但其調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

[1] 湯小軍,黃建春,黃仁彬,等.六月青多糖對(duì)S180荷瘤小鼠免疫功能及p53, Bcl-2, Bax表達(dá)的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(4):250-254.

[2] 湯小軍,黃建春,黃仁彬.六月青多糖抗腫瘤活性研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2013,24(2):354-355.

[3] 薛興陽,付騰飛,邵方元,等.魚腥草總黃酮對(duì)人腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤活性作用[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2013, 22(23):2509-2511.

[4] 陳磊,張敏,謝興亮,等.黃芪組分配伍對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞免疫活性的影響[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2014,34(10):787-790.

[5] Tang XJ, Huang JC, Xiong H, et al. Anti-tumor effects of the polysaccharide isolated from tarphochlamys affinis in H22 tumor-bearing mice[J]. Cell Physiol Biochem, 2016,39(3):1040-1050.

[6] Li J, Bao YX, Lam WK, et al. Immunoregulatory and anti-tumor effects of polysaccharopeptide and Astragalus polysaccharides on tumor-bearing mice[J]. Immunopharmacol Immunotoxicol, 2008,30(4):771-782.

[7] Mohan S, Abdelwahab SI, Kamalidehghana B, et al. Involvement of NF-kB and Bcl2/Bax signaling pathways in the apoptosis of MCF7 cells induced by a xanthone compound pyranocycloartobiloxanthone A[J]. Phytomedicine, 2012,19(11):1007-1015.

[8] Peng W, Ming QL, Han P, et al. Anti-allergic rhinitis effect of caffeoylxanthiazonoside isolated from fruits of Xanthium strumarium L in rodent animals[J]. Phytomedicine, 2014,21(6):824-829.

[9] Xu H, Yu J, Sun Y, et al. Scutellaria barbata D. Don extract synergizes the antitumor effects of low dose 5-fluorouracil through induction of apoptosis and metabolism[J]. Phytomedicine, 2013,20(10):897-903.

[10] Jiang MH, Zhu L, Jiang JG. Immunoregulatory actions of polysaccharides from Chinese herbal medicine[J]. Expert Opin Ther Targets, 2010,14(12):1367-1402.

[11] 林俊,李萍,陳靠山.近5年多糖抗腫瘤活性研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志,2013,38(8):1116-1125.

[12] 姜穎,于英君,劉國良,等.猴頭多糖對(duì)小鼠皮下移植肉瘤的抑制作用及機(jī)制探討[J].山東醫(yī)藥,2015,55(30):8-10.

[13] 莫國艷,黃仁彬,林軍,等.六月青萃取物對(duì)免疫抑制小鼠的影響[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2007,26(11):1264.

[14] Smith AJ, Humphries SE.Cytokine and cytokine receptor gene polymorphisms and their functionality[J].Cytokine Growth Factor Rev, 2009,20(1):43-59.

[15] 王燕瑩,鐘薏,張士強(qiáng),等.艾迪注射液對(duì)Ⅱ、Ⅲ期惡性腫瘤患者Th1/Th2型細(xì)胞因子水平的影響及意義[J].山東醫(yī)藥,2014,54(18):55-56.

[16] 鄒德宏,楊紅健,謝尚鬧,等.乳腺良惡性腫瘤患者血清Th1/Th2細(xì)胞因子中IL-2特點(diǎn)[J].浙江臨床醫(yī)學(xué),2007,9(3):291-292.

[17] 徐繼業(yè),王記南,徐克友,等.化療對(duì)晚期非小細(xì)胞肺癌外周血Th1/Th2細(xì)胞因子表達(dá)的影響[J].實(shí)用癌癥雜志,2012,27(3):230-231.

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81560587)；廣西教育廳高?？茖W(xué)研究項(xiàng)目(2013YB343)。

黃建春(E-mail: huangjianchun008@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.44.009

R730.52

A

1002-266X(2016)44-0030-03

2016-01-04)