解立杰，黃錦秀，胡霽

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院，武漢430077)

丙泊酚靜脈泵注對兔脊髓缺血再灌注損傷的防治作用及其機(jī)制

解立杰，黃錦秀，胡霽

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院，武漢430077)

目的 觀察丙泊酚靜脈泵注對兔脊髓缺血再灌注損傷(SCIRI)的防治作用，并探討其作用機(jī)制。方法 用隨機(jī)數(shù)字表法將36只日本大耳白兔分為假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注組(IR組)、IR+丙泊酚處理組(IR+P組)，各12只；每組設(shè)兩個觀察時間點，分別為再灌注24 h和48 h，每個時點觀察6只。Sham組游離暴露腹主動脈(不阻斷)，IR組和IR+P組動脈夾夾閉腹主動脈30 min建立SCIRI模型；IR+P組于主動脈夾閉前10 min和再灌注即刻分別以微量泵持續(xù)靜脈泵注丙泊酚(30 mg/kg溶于30 mL生理鹽水，輸注速度3 mL/min)，其余兩組在相同時間點以相同的容量、速度泵注生理鹽水。三組動物分于術(shù)后24 h和48 h按Tarlov評分標(biāo)準(zhǔn)行后肢神經(jīng)功能評分，然后處死并取其L4～L6段脊髓組織，觀察病理變化，用Western blotting和RT-PCR分別檢測脊髓組織中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(PKC)ε的蛋白及mRNA。結(jié)果 同一時間點，與IR組相比，IR+P組后肢神經(jīng)功能評分明顯增高(P<0.05)，脊髓損傷減輕，脊髓組織BDNF、PKCε的蛋白及mRNA表達(dá)明顯升高(P均<0.05)。結(jié)論 丙泊酚靜脈泵注對兔SCIRI有一定的防治作用，其作用機(jī)制可能是丙泊酚激活了PKCε/PKC信號通路，上調(diào)了BDNF的表達(dá)。

丙泊酚；脊髓缺血；再灌注損傷；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶ε

脊髓缺血再灌注損傷(SCIRI)是胸腹主動脈修復(fù)術(shù)、胸腹主動脈瘤手術(shù)中常見的并發(fā)癥。在胸腹主動脈修復(fù)術(shù)中，SCIRI的發(fā)生率高達(dá)32%[1]。SCIRI引起的一個嚴(yán)重的并發(fā)癥是截癱。有效防治SCIRI是臨床工作中亟需解決的問題。丙泊酚是常用的靜脈麻醉藥，主要用于麻醉和鎮(zhèn)靜。有研究[2]證實丙泊酚對腦及脊髓損傷有一定的修復(fù)作用。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)對神經(jīng)具有保護(hù)作用，在SCIRI過程中，增加脊髓組織中BDNF表達(dá)可以明顯改善SCIRI的預(yù)后[3]，蛛網(wǎng)膜下腔注入BDNF對脊髓組織損傷亦具有顯著的修復(fù)作用[4]。2015年8月20日～2016年4月20日，我們觀察了丙泊酚靜脈泵注對兔SCIRI的防治作用，并探討了其作用機(jī)制?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及儀器 丙泊酚。BDNF、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(PKC)ε一抗，BCA蛋白定量檢測試劑盒，TRIzol試劑，反轉(zhuǎn)錄試劑盒。微量泵，離心機(jī)，熒光定量PCR儀，紫外分光光度計，蛋白質(zhì)灰度分析軟件。

1.2 實驗動物及其分組 雄性日本大耳白兔36只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注損傷組(IR組)、IR+丙泊酚處理組(IR+P組)，各12只；每組設(shè)兩個研究時點，分別為再灌注24 h和48 h，每個時點觀察6只。實驗前所有動物神經(jīng)系統(tǒng)完好無損，后肢運(yùn)動功能正常。

1.3 各組實驗動物的處理及丙泊酚給予方法 各組實驗動物禁食12 h(自由飲水)后3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)耳緣靜脈注射麻醉，保留自主呼吸，同時耳緣靜脈持續(xù)輸注復(fù)方乳酸鈉林格液6 mL/(kg·h)，持續(xù)監(jiān)測體溫，加熱毯維持動物體溫(38.5±0.5) ℃，股動脈置管監(jiān)測遠(yuǎn)端血壓。Sham組游離暴露腹主動脈(不阻斷)，IR組和IR+P組動脈夾夾閉腹主動脈30 min建立SCIRI模型；IR+P組于主動脈夾閉前10 min和再灌注即刻分別以微量泵持續(xù)靜脈泵注丙泊酚(30 mg/kg溶于30 mL生理鹽水，輸注速度3 mL/min)，其余兩組在相同時間點以相同的容量、速度泵注生理鹽水。所有動物在手術(shù)操作完成后，4萬U青霉素肌注預(yù)防術(shù)后感染，0.25%布比卡因局部浸潤鎮(zhèn)痛，回籠飼養(yǎng)。

1.4 各組實驗動物后肢神經(jīng)功能評價 再灌注24、48 h時由一位未參與實驗動物分組的研究人員對各組各6只動物進(jìn)行后肢功能評分，評分采用改良Tarlov脊髓損傷評分標(biāo)準(zhǔn)[5]：截癱、后肢沒有運(yùn)動能力為0分；后肢有微弱的運(yùn)動功能、微弱的抗重力能力為1分；后肢有較好的抗重力功能但不能拖動為2分；后肢能夠拖動，可跳躍，但沒有恢復(fù)正常為3分；后肢運(yùn)動功能正常為4分。

1.5 各組實驗動物脊髓組織病理學(xué)檢查 再灌注24、48 h時，后肢神經(jīng)功能評分結(jié)束即刻處死動物(各組各6只)，取其L4～L6段脊髓組織，4%甲醛浸泡固定，脫水，石蠟包埋，橫斷面厚度4 μm切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察脊髓組織的形態(tài)：損傷的神經(jīng)元表現(xiàn)為細(xì)胞核固縮或溶解，胞質(zhì)呈嗜伊紅染色，胞質(zhì)中尼氏體減少或消失及神經(jīng)元周圍有空泡形成；正常神經(jīng)元表現(xiàn)為多角形結(jié)構(gòu)，胞核結(jié)構(gòu)清晰，胞質(zhì)中尼氏體存在。

1.6 各組實驗動物脊髓組織中BDNF、PKCε蛋白檢測 采用Western blotting法。取脊髓組織標(biāo)本，冰上裂解、勻漿，12 000 g離心5 min，取上清液，即總蛋白液，BCA法測定蛋白濃度。等量蛋白樣品上樣，經(jīng)12%的SDS-PAGE電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，脫脂牛奶封閉后分別加入BDNF、PKCε一抗(1∶1 000 稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST洗后加入1∶3 000酶標(biāo)記羊抗小鼠二抗稀釋液，室溫下孵育30 min，室溫下用TBST緩沖液在脫色搖床上洗3次，每次5 min。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，曝光、顯影、定影。凝膠成像系統(tǒng)觀察，Alpha軟件分析目標(biāo)蛋白條帶的光密度值，GAPDH作內(nèi)參，目標(biāo)蛋白條帶光密度值與內(nèi)參條帶光密度值的比值標(biāo)化后表示目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 各組實驗動物脊髓組織中BDNF、PKCε mRNA檢測 采用RT-PCR法。用TRIzol試劑提取受檢脊髓組織總mRNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明對RNA樣本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。BDNF引物序列：上游5′-CAACGAAGAAAACAATAAGGACGC-3′,下游5′-CGCCGGACCCTCATAGACAT-3′；PKCε引物序列：上游5′-TGGCGTCTCAGAACTGCTCAAG-3′，下游5′-CGCACCCGCTCATACAACTC-3′；GAPDH引物序列：上游5′-CGCCTGGAGAAAGCTGCTA-3′，下游5′-ACGACCTGGTCCTCGGTGTA-3′；擴(kuò)增片段長度分別為147、165、104 bp。PCR反應(yīng)體系的配制、反應(yīng)參數(shù)等均按Fast Start Universal SYBR Green Master(Rox)試劑盒說明進(jìn)行；反應(yīng)條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，72 ℃、20 s，40個循環(huán)。將2-ΔΔCt值標(biāo)化后表示目標(biāo)mRNA的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 再灌注24、28 h時各組實驗動物后肢神經(jīng)功能評分比較 實驗前所有兔子后肢運(yùn)動功能正常。再灌注24、48 h時，IR+P組、IR組后肢神經(jīng)功能評分與Sham組相比，P均<0.05；兩個時間點IR+P組后肢神經(jīng)功能評分與IR組相比，P均<0.05。結(jié)果詳見表1。

表1 再灌注24、28 h時三組實驗動物后肢神經(jīng)功能

2.2 各組實驗動物脊髓組織病理學(xué)變化 Sham組再灌注24、48 h時脊髓組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，輪廓完整，核圓，胞質(zhì)飽滿，核仁清晰(見圖1A、D)。IR組再灌注24 h時脊髓組織部分神經(jīng)元固縮、核溶解、尼氏體明顯減少(見圖1B);再灌注48h時神經(jīng)元結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，胞核大量溶解，幾乎見不到正常運(yùn)動神經(jīng)元，部分神經(jīng)細(xì)胞周圍可見較多空泡形成(見圖1E)。IR+P組再灌注24、48 h時脊髓組織神經(jīng)元病理變化明顯輕于IR組，部分脊髓神經(jīng)元輕度萎縮，核仁輕度萎縮，少有胞核顏色變淡、消失，細(xì)胞腫脹、少許空泡形成，組織損傷明顯減輕(見圖1C、F)。

注：A:Sham組，再灌注 24 h；B:IR組，再灌注24 h；C:IR+P組，再灌注24 h；D: Sham組，再灌注48 h；E: IR組，再灌注48 h；F: IR+P組，再灌注48 h。

圖1 各時間點各組脊髓組織病理形態(tài)(HE染色，400×)

2.3 各組實驗動物脊髓組織BDNF、PKCε蛋白的表達(dá)比較 再灌注24、48 h時，各組實驗動物脊髓組織BDNF、PKCε蛋白的表達(dá)比較見表2。

表2 再灌注24、48 h時各組實驗動物脊髓組織BDNF、PKCε蛋白的相對表達(dá)量比較±s)

注：與Sham組相比，#P<0.05;與IR組相比，*P<0.05。

2.4 各組實驗動物脊髓組織BDNF、PKCε mRNA的表達(dá)比較 再灌注24、48 h時各組實驗動物脊髓組織BDNF、PKCε mRNA的表達(dá)比較見表3。

表3 再灌注24、48 h時各組實驗動物脊髓組織BDNF、PKCε mRNA的相對表達(dá)量比較

注：與Sham組相比，#P<0.05;與IR組相比，*P<0.05。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，IR+P組兔的神經(jīng)功能評分明顯增高、脊髓損傷明顯減輕，說明丙泊酚靜脈泵注對兔SCIRI有一定的防治作用。

BDNF作為神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的成員之一，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中對神經(jīng)元的生長、分化和維持其正常的生理功能起著關(guān)鍵作用[6]。有研究[7]發(fā)現(xiàn)，BDNF與腦組織缺血缺氧損傷有著密切的關(guān)系，BDNF能夠抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，對缺血損傷的腦細(xì)胞有一定的保護(hù)作用[8]。BDNF在脊髓損傷的發(fā)生發(fā)展過程中也扮演著極其重要的角色，同時BDNF極有可能對脊髓機(jī)械性和缺氧性損傷具有良好的的治療作用[9]。在大鼠SCIRI過程中，增加其脊髓組織中BDNF表達(dá)可以明顯改善大鼠的預(yù)后[3]，同時蛛網(wǎng)膜下腔注入BDNF對損傷脊髓組織亦具有保護(hù)作用[4]。有研究[10]發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可以促進(jìn)大鼠腦海馬組織BDNF的表達(dá)，對小鼠腦慢性缺血性損傷具有改善作用。本研究結(jié)果顯示，丙泊酚靜脈泵注后，SCIRI兔的脊髓組織中BDNF表達(dá)明顯增多。我們推測丙泊芬通過改變BDNF的表達(dá)對脊髓組織產(chǎn)生了一定的保護(hù)作用，從而減輕了脊髓組織的損傷。

PKC廣泛分布于哺乳動物的組織和細(xì)胞中，對細(xì)胞的生長代謝、增殖分化等發(fā)揮重要作用。 PKCε 是PKC的一個亞型。Neumann等[11]發(fā)現(xiàn)，用PKCε 預(yù)處理可以增加大鼠腦組織BDNF的表達(dá)。也有研究[12]證實，丙泊酚對大腦皮質(zhì)神經(jīng)元中的PKCε 具有一定的激活作用。本研究發(fā)現(xiàn)，給予丙泊酚后，SCIRI兔的脊髓組織中PKCε 表達(dá)明顯增加，這可能是丙泊酚減輕脊髓損傷的機(jī)制之一。

綜上所述，丙泊酚靜脈泵注對兔SCIRI有一定的防治作用，其作用機(jī)制可能是丙泊酚激活了PKCε /PKC信號通路，PKCε 表達(dá)增加，進(jìn)一步促進(jìn)了BDNF的表達(dá)。這一研究結(jié)果為臨床防治SCIRI提供了新的思路。

[1] Panthee N, Ono M. Spinal cord injury following thoracic and thoracoabdominal aortic repairs [J]. Asian Cardiovasc Thorac Ann, 2015,23(2):235-246.

[2] Yu Q, Hu J, Yang J, et al. Protective effect of propofol preconditioning and postconditioning against ischemic spinal cord injury [J]. Neural Regen Res, 2011,6(12):951-955.

[3] Wang Y, Su R, Lv G, et al. Supplement Zinc as an effective treatment for spinal cord ischemia/reperfusion injury in rats [J]. Brain Res, 2014,1545(4):45-53.

[4] Novikova LN, Novikov LN, Kellerth JO. Survival effects of BDNF and NT-3 on axotomizedrubrospinal neurons depend on the temporal pattern of neurotrophin administration [J]. Eur J Neurosci, 2000,12 (2):776-780.

[5] Fang B, Li X, Sun X, et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption [J]. Int J Mol Sci, 2013,14(5):10343-10354.

[6] Wenjin W, Wenchao L, Hao Z, et al. Electrical stimulation promotes BDNF expression in spinal cord neurons through Ca2+and Erk-dependent signaling pathways [J]. Cell Mol Neurobiol, 2011,31(3):459-467.

[7] Sendtner M, Pei G, Beck M, et al. Developmental motoneuron cell death and neurotrophic factors[J]. Cell Tissue Res, 2000,301(1):71-84.

[8] Zhao J, Xu H, Tian Y, et al. Effect of electroacupuncture on brain-derived neurotrophic factor mRNA expression in mouse hippocampus following cerebral ischemia-reperfusion injury [J]. J Tradit Chin Med, 2013,33(2):253-257.

[9] Weishaupt N, Blesch A, Fouad K. BDNF: the career of a multifaceted neurotrophin in spinal cord injury [J]. Exp Neurol, 2012,238(2):254-264.

[10] Chen G, Fu Q, Cao J, et al. Effect of propofol on brain-derived neurotrophic factor and tyrosine kinase receptor B in the hippocampus of aged rats with chronic cerebral ischemia [J]. Neural Regen Res, 2012,7(21):1645-1649.

[11] Neumann JT, Thompson JW, Raval AP, et al. Increased BDNF protein expression after ischemic or PKC epsilon preconditioning promotes electrophysiologic changes that lead to neuroprotection [J]. J Cereb Blood Flow Meta, 2015,35(1):121-130.

[12] Song C, Xi H, Yang L, et al. Propofol inhibited the delayed rectifier potassium current (I-k) via activation of protein kinase C epsilon in rat parietal cortical neurons[J]. Eur J Pharmacol, 2011,653(1-3): 16-20.

湖北省自然科學(xué)基金資助項目(2013CFB086)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)專項資金資助項目(2016YXZDO24)。

胡霽(E-mail: hbwhly01@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.43.012

R744

A

1002-266X(2016)43-0041-03

2016-05-26)