曹麗，孫陽陽，曹若瓊，張毅，王建飛，鐘理,2

(1河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002；2 Western University of Health Sciences，California 91766，USA)

非小細(xì)胞肺癌患者血漿RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因甲基化狀態(tài)觀察

曹麗1，孫陽陽1，曹若瓊1，張毅1，王建飛1，鐘理1,2

(1河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002；2 Western University of Health Sciences，California 91766，USA)

目的 觀察非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者血漿抑癌基因runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(RUNX3)、ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族基因1A( RASSF1A)、3-0-硫基轉(zhuǎn)移酶-2 (3-OST-2)、死亡相關(guān)蛋白激酶(DAPK)、膜結(jié)合受體型蛋白酪氨酸磷酸酶O(PTPRO)等基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)。方法 采用甲基化特異PCR技術(shù)對63例NSCLC患者血漿中RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因是否甲基化進(jìn)行觀察，并以25例健康人作對照。結(jié)果 NSCLC患者血漿中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因檢出率分別為46.0%、50.8%、26.9%、34.9%、41.3%；健康人血漿中甲基化PTPRO基因檢出率為12.0%，而甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK均未檢出；兩者甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因檢出率相比，P均<0.05。NSCLC患者血漿中上述5種甲基化基因聯(lián)合檢測的敏感度為88.9%、特異度為88.0%。血漿甲基化RUNX3基因檢出率與NSCLC的病理類型、臨床分期以及分化程度有關(guān)(P均<0.05)；甲基化RASSF1A基因檢出率與NSCLC的分化程度有關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 NSCLC患者血漿中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因檢出率明顯高于健康人。聯(lián)合檢測血漿中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因有可能會有助于NSCLC的早期診斷及其生物學(xué)行為的判斷。

抑癌基因；runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3基因；ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族基因1A；3-0-硫基轉(zhuǎn)移酶-2基因 ；死亡相關(guān)蛋白激酶基因；膜結(jié)合受體型蛋白酪氨酸磷酸酶O基因；甲基化基因；基因啟動(dòng)子區(qū)域；肺腫瘤；非小細(xì)胞肺癌

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌總數(shù)的80%[1]，由于缺乏良好的早期診斷手段，以至于很多患者在臨床確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過了最佳治療時(shí)期。因此，尋找一種簡單而有效的早期診斷方法是必要的。有研究[2]發(fā)現(xiàn)，抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島異常甲基化與肺癌的發(fā)生有關(guān)。腫瘤患者壞死的腫瘤細(xì)胞可釋放 DNA 進(jìn)入血液循環(huán)中，且與相應(yīng)的原發(fā)腫瘤細(xì)胞在遺傳特性上相一致，從而為循環(huán) DNA 在腫瘤診治中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)[3]。本研究采用甲基化特異PCR(MSP)技術(shù)，對非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者血漿中抑癌基因runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(RUNX3)、ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族基因1A(RASSF1A)、3-0-硫基轉(zhuǎn)移酶-2 (3-OST-2)、死亡相關(guān)蛋白激酶(DAPK)、膜結(jié)合受體型蛋白酪氨酸磷酸酶O(PTPRO)等基因的甲基化狀態(tài)進(jìn)行了觀察。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2015年3月～2016年5月河北大學(xué)附屬醫(yī)院和保定市第一中心醫(yī)院確診的NSCLC患者63例，男51例，女12 例；年齡37～72歲；其中鱗癌25例，腺癌38例。所有NSCLC患者受檢前未接受過化療及放療。另選擇25例健康人作對照，男14例，女11例；年齡34～57歲。

1.2 血漿RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因甲基化狀態(tài)觀察 ①樣本采集：受檢對象于清晨空腹采集肘靜脈血，置EDTA紫色抗凝管，3 000 g/min 離心10 min，分離獲得血漿，-80 ℃儲存，用于提取基因組DNA。②DNA提?。翰捎肣IAamp Blood Mini Kit試劑盒(德國Qiagen公司)提取血漿中的基因組DNA(A260/A280在1.79 ～ 1.89)，-20 ℃儲存。③DNA的甲基化修飾：采用Epi Tect Bisulfite Kit試劑盒(德國Qiagen公司)對所提取的DNA進(jìn)行亞硫酸修飾。④ 甲基化修飾DNA的擴(kuò)增及檢測 ：RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因啟動(dòng)子引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[4～8], 引物序列見表1，所有引物由生工生物工程(北京)有限公司合成。用Epi Tect MSP Kits試劑盒(德國Qiagen公司)進(jìn)行MSP擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL：修飾后的DNA 2 μL，上下引物各1 μL，Epi Tect Master Mix 12.5 μL，去RNase水8.5 μL。反應(yīng)條件：第一步，95 ℃ 10 min；第二步，94 ℃ 30 s，各自的退火溫度 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；第三步，72 ℃ 延伸10 min。以甲基化轉(zhuǎn)移酶M. SssI處理健康人的DNA作陽性對照，未處理的DNA作陰性對照，并以ddH2O作空白對照。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳顯帶。將甲基化引物擴(kuò)增出條帶、非甲基化引物未出現(xiàn)條帶的樣本判定為甲基化；將非甲基化引物擴(kuò)增出條帶、甲基化引物未擴(kuò)增出條帶的樣本判定為未甲基化；將甲基化引物和未甲基化引物都出現(xiàn)條帶的(部分甲基化)亦判定為甲基化。

表1 RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因的引物序列

注：M為甲基化，U為未甲基化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。相關(guān)性分析用Fisher 精確檢驗(yàn)法和χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。敏感度=真陽性例數(shù) /(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%，特異度=真陰性例數(shù) /(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC患者血漿中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因檢出率 63例NSCLC患者血漿中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因檢出率分別為46.0%(29/63)、50.8%(32/63)、26.9%(17/63)、34.9%(22/63)、41.3%(26/63)；健康人血漿中甲基化PTPRO基因檢出率為12.0%(3/25)，而甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK均未檢出；兩者甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因檢出率相比，P均<0.05。甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、 DAPK、PTPRO基因電泳結(jié)果見圖1。

2.2 NSCLC患者血漿中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因聯(lián)合檢測的敏感度和特異度 63例NSCLC患者中，56例至少有1種基因發(fā)生甲基化，5種甲基化基因聯(lián)合檢測的敏感度為88.9%、特異度為88.0%。其中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK基因單獨(dú)檢測的敏感度分別為46.0%、50.8%、26.9%、34.9%，特異度均為100%；PTPRO基因單獨(dú)檢測的敏感度為41.3%，特異度為88.0%。多個(gè)基因聯(lián)合檢測的的敏感度、特異度見表2。

注：A為RUNX3基因,B為RASSF1A基因,C為 3-OST-2基因,D為 DAPK基因,E為 PTPRO基因;M為甲基化條帶,U為未甲基化條帶;1為完全甲基化,2為部分甲基化,3為完全未甲基化,4為陽性對照,5為陰性對照,ddH2O為空白對照。

圖1 甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因電泳圖

表2 NSCLC患者血漿中5株甲基化基因聯(lián)合檢測的敏感度和特異度

2.3 血漿中RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因甲基化與NSCLC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 血漿中RUNX3基因甲基化與NSCLC的病理類型、分期以及分化程度有關(guān)(P均<0.05)，但與患者年齡、性別及吸煙程度無關(guān)(P均>0.05)。RASSF1A基因甲基化與NSCLC的分化程度有關(guān)(P<0.05)。3-OST-2、 DAPK、PTPRO基因甲基化與NSCLC的各臨床病理參數(shù)無關(guān)(P均>0.05)。詳見表3。

3 討論

近年來，我國癌癥發(fā)病率不斷上升，其中肺癌居于首位。腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制主要是原癌基因激活、抑癌基因失活以及其他基因表達(dá)異常[9]。抑癌基因失活的一個(gè)重要機(jī)制就是該基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島發(fā)生甲基化[10]。異常甲基化DNA有望成為診斷某些腫瘤的分子標(biāo)記物[11]。 常見的與肺癌有關(guān)的抑癌基因有20多種，其中就包括RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、 DAPK、PTPRO基因[6]。本研究結(jié)果顯示，NSCLC患者血漿中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因檢出率明顯高于健康人。

表3 RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因

注：M為甲基化，U為未甲基化。

RUNX3基因表達(dá)的缺失將導(dǎo)致Smad 蛋白功能受限制[12]，進(jìn)而影響TGF-β信號通路，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13]。RUNX3基因的甲基化導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)，這種情況存在于乳腺癌、膀胱癌、肺癌中。本研究結(jié)果顯示，NSCLC患者血漿中甲基化RUNX3基因檢出率達(dá)46.0%，并與NSCLC病理分型、臨床分期和分化程度有關(guān)系，其中腺癌檢出率(22/38)高于鱗癌(7/25)，臨床分期為Ⅲ、Ⅳ期患者的RUNX3基因甲基化率(19/32)明顯高于Ⅰ、Ⅱ期患者(10/31)，分化程度低的患者(22/37)也高于高中分化的患者(7/26)，與文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致。

RASSF1A基因是ras凋亡家族成員，位于3p21.3[15]。有50%～80%的NSCLC及90%的小細(xì)胞肺癌中存在 3p21.3 純和性缺失，所以該基因是一種肺癌的特異性抑癌基因[16]。本研究結(jié)果顯示，NSCLC患者血漿中甲基化RASSF1A基因檢出率為50.0%，且甲基化RASSF1A基因檢出率在低分化NSCLC患者中高于高中分化患者。

3-OST-2基因編碼的O-硫基轉(zhuǎn)移酶參與修飾硫酸乙酰肝素糖蛋白的氨基葡聚糖，而硫酸肝素蛋白聚糖可以通過與許多各種不同的生長因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用而在腫瘤細(xì)胞的生長、黏附和遷移過程中發(fā)揮重要作用。Narayan等[17]研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者肺癌組織中甲基化3-OST-2基因檢出率高于癌旁組織，且NSCLC分期越高的肺癌組織中甲基化3-OST-2基因檢出率越高。本研究未得出同樣的結(jié)果，可能與材料以及試驗(yàn)方法不同有關(guān)。

DAPK基因參與FAS、p53、TNG-α、TGF-β等多種細(xì)胞凋亡因子的傳導(dǎo)途徑，在細(xì)胞凋亡系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[18]。Belinsky等[19]研究發(fā)現(xiàn)，DAPK基因啟動(dòng)子異常甲基化是肺癌發(fā)生的早期事件。本研究發(fā)現(xiàn)，甲基化DAPK基因在NSCLC血漿中的檢出率為34.9%，而健康人血漿中未檢出。甲基化DAPK基因檢出率在鱗癌、低分化、臨床分期比較晚的NSCLC相對較高，但與腺癌、中高分化及分期低的NSCLC相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

蛋白酪氨酸激酶( PTK)的活性改變能影響細(xì)胞的增殖、黏附、侵襲等，有促進(jìn)正常細(xì)胞向癌變轉(zhuǎn)化的功能[20,21]。蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs) 功能與PTK相反，在抵抗癌變的過程中發(fā)揮重要作用。PTPRO基因作為PTPs家族的一員，具有潛在的抑癌作用。本研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者血漿中甲基化PTPRO基因檢出率為41.3%，其與NSCLC患者的臨床理參數(shù)無關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合檢測NSCLC患者血漿中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因，敏感度達(dá)88.9%、特異度為88.0%，明顯高于單個(gè)甲基化基因的檢出率。聯(lián)合檢測血漿中甲基化RUNX3、RASSF1A、3-OST-2、DAPK、PTPRO基因有可能會有助于NSCLC的早期診斷及其生物學(xué)行為的判斷。

[1] 鐘英, 孫建鷹, 杜明華. PTN、Cyfra212l和CEA聯(lián)合檢測對肺癌診斷的研究 [J]. 醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào), 2009, 22(12): 1281-1283.

[2] Santini V, Kantarjian HM, Issa JP. Changes in DNA methylation in neoplasia: pathophysiology and therapeutic implications [J]. Ann Intern Med, 2001,134(7):573-586.

[3] Hsu HS, Chen TP, Hung CH, et al. Characterization of a multiple epigenetic marker panel for lung cancer detection and risk assessment in plasma [J]. Cancer, 2007,110(9):2019-2026.

[4] 唐國華,趙強(qiáng),賀修勝,等.RUNX3基因啟動(dòng)子CpG島甲基化對胃組織癌變影響的研究[J].中華腫瘤防治雜志,2012,19(14):1069-1073.

[5] Endoh H, Yatabe Y, Shimizu S, et al. RASSF1A gene inactivation in non-small cell lung cancer and its clinical implication [J]. Int J Cancer, 2003,106(1):45-51.

[6] Miyamoto K, Asada K, Fukutomi T, et al. Methylation associated silencing of heparan sulfate D-glucosaminyl 3-O-sulfotransferase-2 (3-OST-2) in human breast, colon, lung and pancreatic cancers [J]. Oncogene, 2003,22(2):274-280.

[7] Herman JG, Graff JR, Myohanen S, et al. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93(18):9821-9826.

[8] Motiwala T, Kutay H, Ghoshal K, et al. Protein tyrosine phosphatase receptor-type O (PTPRO) exhibits characteristics of a candidate tumor suppressor in human lung cancer [J]. Proc Natl Acad Sci, 2004,101(388):13844-13849.

[9] 許德兵.分子生物標(biāo)志物在肺癌早期診斷中的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)研究學(xué)報(bào),2003,26(7)：766-770.

[10]Wajed SA, Laird PW, DeMeester TR. DNA methylation: an alternative pathway to cancer [J]. Ann Surg, 2001,234(1):10-20.

[11] Ahuja N, Issa JP. Aging, methylation and cancer [J]. Histol Histopathol, 2000,15(3):835-842.

[12] Levanon D, Negreanu V, Bernstein Y, et al. AML2, and AML3, the human members of the runt domain gene-family: cDNA structure, expression, and chromosomal localization [J]. Genomics, 1994,23(2):425-432.

[13] Blyth K, Cameron ER, Neil JC. The RUNX3 genes: gain or loss of function in cancer [J]. Nat Rev Cancer, 2005,5(5):376-387.

[14] Yanagawa N, Tamura G, Oizumi H, et al. Promoter hypermethylation of RASSF1A and RUNX3 gene as an independent prognostic prediction marker in surgically resected non-small cell lung cancers [J]. Lung Cancer, 2007,58(1):131-138.

[15] Damman R, Li C, Yoon JH, et al. Epigenetic inactivation of a RAS association domain family protein form the lung tumor suppressor locus 3p21.3 [J]. Nat Genet, 2000,25(3):315-319.

[16] Wistuba II, Behrens C, Virmani AK, et al. High resolution chromosome 3p allelotyping of human lung cancer and preneoplastic/preinvasive bronchial epithelium reveals multiple, discontinuous sites of 3p allele loss and three regions of frequent breakpoints [J]. Cancer Res, 2000,60(7):1949-1960.

[17] Shivapurkar N, Stastny V, Suzuki M, et al. Application of a methylation gene panel by quantitative PCR for lung cancers [J]. Cancer Lett, 2007,247(1):56-71.

[18] 閔衛(wèi)利，王西京. 死亡相關(guān)蛋白激酶與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展 [J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué), 2005,13(6):854-857.

[19] Belinsky SA, Palmisano WA, Gilliland FD, et al. Aberrant promoter methylation in bronchial epithelium and sputum from current and former smokers [J]. Cancer Res, 2002,62(8):2370-2377.

[20] Blume-Jensen P, Hunter T. Oncogenic kinase signaling[J]. Nature, 2001,411(6835):355-365.

[21] 臧真真，劉泓基.脾酪氨酸激酶蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J].山東醫(yī)藥，2010,50(5):59-60.

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81272444，81472744)。

鐘理 (E-mail: lee_z@yahoo.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.43.028

R734.2

B

1002-266X(2016)43-0084-04

2016-08-11)