劉貴春，江朝秀，彭鐫寶，魏靜文，劉慶，倪玉霞

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

·基礎(chǔ)研究·

腹腔注射丙酮酸乙酯腦缺血再灌注大鼠認(rèn)知功能、海馬Nrf2基因表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞線粒體形態(tài)變化

劉貴春，江朝秀，彭鐫寶，魏靜文，劉慶，倪玉霞

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

目的 觀察腹腔注射丙酮酸乙酯腦缺血再灌注大鼠認(rèn)知功能、海馬組織核因子E2相關(guān)因子(Nrf2)及其靶基因表達(dá)、海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體形態(tài)變化。方法 將66只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(F組)、缺血再灌注組(IR組)、丙酮酸乙酯組(EP組)，各22只。F組只分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈(不做動(dòng)脈阻斷處理)，IR組、EP組采用二血管阻斷法建立腦缺血再灌注模型；EP組于血流恢復(fù)后腹腔注射丙酮酸乙酯，F(xiàn)組、IR組腹腔注射等量0.9% NaCl注射液，連續(xù)7 d。術(shù)前第1天及術(shù)后第4天、第7天進(jìn)行水迷宮測(cè)試，評(píng)估三組大鼠認(rèn)知功能；術(shù)后第7天水迷宮測(cè)試后，RT-PCR檢測(cè)三組大鼠海馬組織中Nrf2、HO-1、γ-GCS、NQO1的mRNA，電鏡觀察其海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體形態(tài)。結(jié)果 術(shù)前第1天,三組大鼠水迷宮測(cè)試成績(jī)相近(P均>0.05)；術(shù)后第4天、第7天，IR組、EP組的水迷宮測(cè)試成績(jī)低于F組(P均<0.05)，而EP組水迷宮成測(cè)試績(jī)高于IR組(P<0.05)。術(shù)后第7天，IR組、EP組海馬組織Nrf2、HO-1、γ-GCS、NQO1的mRNA相對(duì)表達(dá)量高于F組(P均<0.05)，且EP組高于IR組(P均<0.05)。術(shù)后第7天，F(xiàn)組海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體形態(tài)正常，內(nèi)嵴清晰整齊，電子透明度高；IR組海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體內(nèi)嵴損傷、裂斷，電子透明度低；EP組海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體損傷比IR組輕，只有少部分的線粒體內(nèi)嵴損傷、裂斷少，電子透明度高。結(jié)論 腦缺血再灌注大鼠腹腔注射丙酮酸乙酯后，其認(rèn)知功能得到改善，腦組織Nrf2及其靶基因表達(dá)增強(qiáng)(抗氧化能力提高)，神經(jīng)細(xì)胞的線粒體損傷減輕。

腦缺血再灌注；缺血再灌注損傷；丙酮酸乙酯；認(rèn)知功能；核因子E2相關(guān)因子；核因子E2相關(guān)因子靶基因；線粒體；神經(jīng)細(xì)胞；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

腦缺血再灌注損傷是指腦缺血恢復(fù)血供后，其損傷不但未減輕反而進(jìn)一步加重的現(xiàn)象[1]。氧化應(yīng)激在腦缺血再灌注損傷中占有重要的地位。研究[2]表明，核因子E2相關(guān)因子(Nrf2)-抗氧化反應(yīng)調(diào)控元件(ARE)在抵抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用?？寡趸蜣D(zhuǎn)錄過程主要通過激活Nrf2來調(diào)節(jié)ARE，ARE可以編碼抗氧化酶的基因而發(fā)揮抗氧化作用。Nrf2及其下游靶基因參與細(xì)胞抗氧化應(yīng)激過程，Nrf2下游靶基因主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、γ-谷氨酸合成酶(γ-GCS)、醌氧化還原酶(NQO1)、血紅素加氧酶(HO-1)基因等。研究[3]發(fā)現(xiàn)，丙酮酸乙酯能提高全腦缺血再灌注損傷后大鼠血清中的SOD水平，發(fā)揮腦保護(hù)作用。2015年1月25日～2016年2月24日，我們觀察了腹腔注射丙酮酸乙酯后腦缺血再灌注大鼠認(rèn)知功能、海馬組織Nrf2及其靶基因表達(dá)、海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體形態(tài)的變化情況?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥物及儀器 清潔級(jí)健康雄性成年SD大鼠66只，體質(zhì)量250～300 g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。丙酮酸乙酯購自美國(guó)Sigma公司。熒光定量 PCR 96孔板(型號(hào)：PCR-96-FLT-C)，普通PCR儀(型號(hào)：EDC-810)，Morris水迷宮(型號(hào)：ACT-200A)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組、腦缺血再灌注模型制作及丙酮酸乙酯給予方法 將66只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(F組)、缺血再灌注組(IR組)、丙酮酸乙酯組(EP組)，每組22只。各組大鼠術(shù)前(即造模前)進(jìn)行連續(xù)4 d的水迷宮訓(xùn)練。F組只分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈(不做動(dòng)脈阻斷處理)，IR組、EP組采用二血管阻斷法建立腦缺血再灌注模型(將麻醉后的大鼠固定在手術(shù)板上，于其頸部正中做手術(shù)切口，游離左、右兩側(cè)頸總動(dòng)脈后，用動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，夾閉30 min后放開雙側(cè)動(dòng)脈夾，恢復(fù)血流)；EP組于血流夾，恢復(fù)后腹腔注射丙酮酸乙酯40 mg/(kg·d)，連續(xù)7 d；F組、IR組腹腔注射等量0.9% NaCl注射液，連續(xù)7 d。

1.2.2 大鼠認(rèn)知功能測(cè)試 術(shù)前第1天及術(shù)后第4天、第7天進(jìn)行水迷宮測(cè)試，評(píng)估大鼠的認(rèn)知功能，觀察指標(biāo)包括逃避潛伏期、穿環(huán)次數(shù)以及T象限游泳距離百分比等。

1.2.3 大鼠海馬組織中Nrf2、HO-1、γ-GCS、NQO1的mRNA檢測(cè) 術(shù)后第7天，每組隨機(jī)取出6只大鼠，麻醉后斷頭取新鮮海馬組織，充分?jǐn)囁橹瞥蓜驖{，加入裂解液裂解。用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)海馬組織中Nrf2、HO-1、γ-GCS、NQO1的mRNA，按各試劑盒說明操作，以相對(duì)表達(dá)量表示。

1.2.4 大鼠海馬組織中神經(jīng)細(xì)胞線粒體形態(tài)觀察 術(shù)后第7天，每組隨機(jī)取出3只大鼠，通過心臟灌注預(yù)冷0.9% NaCl注射液500 mL，2%多聚甲醛和2.5%戊二醛固定液灌注300 mL，斷頭切取海馬CA1區(qū)2 mm3，浸泡在電鏡固定液中，3%戊二醛固定2 h以上，0.1 mol磷酸緩沖液清洗3次，1%鋨酸固定1 h，乙醇-丙酮逐級(jí)脫水；丙酮包埋滲透，聚合、修塊、醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色。電鏡觀察海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠認(rèn)知功能比較 大鼠認(rèn)知功能以水迷宮測(cè)試的大鼠逃避潛伏期、穿環(huán)次數(shù)及T象限游泳距離百分比表示。術(shù)前第1天三組各指標(biāo)相比，P均>0.05；同一時(shí)間點(diǎn)EP組、IR組各指標(biāo)與F組相比，P均<0.05；同一時(shí)間點(diǎn)EP組各指標(biāo)與IR組相比，P均<0.05；不同時(shí)間點(diǎn)EP組各指標(biāo)相比，P均<0.05；不同時(shí)間點(diǎn)IR組各指標(biāo)相比，P<0.05；不同時(shí)間點(diǎn)F組各指標(biāo)相比，P均>0.05。結(jié)果詳見表1。

表1 各時(shí)間點(diǎn)三組大鼠逃避潛伏期、穿環(huán)次數(shù)及T象限游泳距離百分比±s)

2.2 三組大鼠海馬組織中Nrf2、HO-1、γ-GCS、NQO1的mRNA表達(dá)比較 術(shù)后第7天三組大鼠馬組織中Nrf2、HO-1、γ-GCS、NQO1的mRNA表達(dá)比較見表2。

表2 三組大鼠海馬組織中Nrf2、HO-1、γ-GCS、NQO1的mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與F組相比，▲P<0.05；與IR組相比，▽P<0.05。

2.3 三組大鼠海馬組織中神經(jīng)細(xì)胞線粒體形態(tài) 術(shù)后第7天，F(xiàn)組馬組織中神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)較為規(guī)則，大量線粒體分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，其內(nèi)嵴清晰整齊，透明度高，見圖1；IR組大量神經(jīng)細(xì)胞線粒體內(nèi)嵴損傷、裂斷，出現(xiàn)大量變性空泡，可見高電子密度的顆粒分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，染色質(zhì)聚集而不均勻，見圖2；EP組神經(jīng)細(xì)胞的線粒體損傷比IR組輕，少部分線粒體破壞，可見少數(shù)染色質(zhì)聚集，見圖3。

圖1 F組海馬組織神經(jīng)細(xì)胞線粒體形態(tài) 圖2 IR組海馬組織神經(jīng)細(xì)胞線粒體形態(tài) 圖3 EP組海馬組織神經(jīng)細(xì)胞線粒體形態(tài)

3 討論

有研究[4，5]發(fā)現(xiàn)，大量神經(jīng)元結(jié)構(gòu)缺失，甚至死亡、凋亡，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體神經(jīng)傳導(dǎo)以及信息處理能力發(fā)生異常，出現(xiàn)學(xué)習(xí)及記憶能力下降。陳志則等[6]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠全腦缺血再灌注損傷后認(rèn)知功能明顯下降。本研究結(jié)果也顯示，大鼠腦缺血再灌注后認(rèn)知能下降明顯，但腹腔注射丙酮酸乙酯后大鼠認(rèn)知功能得到改善。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，術(shù)后第7天，與R組相比，IR組海馬組織中Nrf2、HO-1、γ-GCS、NQO1的mRNA表達(dá)水平明顯提高。上述結(jié)果表明缺血再灌注本身啟動(dòng)了腦組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，激活了Nrf2-ARE通路；而EP組海馬組織中Nrf2、HO-1、γ-GCS、NQO1的mRNA表達(dá)水平更高于IR組。上述結(jié)果表明丙酮酸乙酯的應(yīng)用通過進(jìn)一步激活海馬神經(jīng)細(xì)胞Nrf2-ARE通路，提高了缺血再灌注后腦組織的抗氧化應(yīng)激能力。Nrf2-ARE通路激活后可以有效對(duì)抗自由基對(duì)腦組織的損傷[7]。Ren等[8]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇通過激活Nrf2-ARE通路，顯著上調(diào)大鼠海馬組織中Nrf2、HO-1和NQO1的表達(dá)，本研究結(jié)果與此相符。正常情況下，Nrf2和細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白Keap1以N端的Neh2區(qū)域結(jié)合成二聚體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，使保護(hù)細(xì)胞的酶類和抗氧化物質(zhì)處于基礎(chǔ)表達(dá)水平，細(xì)胞處于穩(wěn)定狀態(tài)[9]。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激因子或親核物質(zhì)刺激后，Keap1中的巰基改變或通過蛋白激酶C途徑使Nrf2磷酸化，Nrf2和Keap1解離后，Nrf2轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與Maf、JunD、cJun、ATF4等形成雜合二聚體，與ARE啟動(dòng)子部位結(jié)合，啟動(dòng)下游多種保護(hù)性基因的表達(dá)[10，11]。

本研究通過透射電鏡觀察腦缺血再灌注后大鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞線粒體發(fā)現(xiàn)，IR組神經(jīng)細(xì)胞的線粒體遭到嚴(yán)重破壞，EP組神經(jīng)細(xì)胞的線粒體損傷明顯比IR組輕。研究者[12]發(fā)現(xiàn)，在腦組織缺血再灌注損傷過程中產(chǎn)生了毒性氨基酸、大量氧自由基以及游離狀態(tài)的脂肪酸，線粒體的通道通透性被破壞，導(dǎo)致其能量代謝異常。向麗等[13]在研究腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，山萘酚可減輕腦缺血再灌注大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的損傷。本研究結(jié)果與此相符?？赡苁潜嵋阴?duì)線粒體的功能和結(jié)構(gòu)發(fā)揮了保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能與減輕線粒體的水腫、提高線粒體呼吸鏈的活性有關(guān)。

總之，腦缺血再灌注大鼠腹腔注射丙酮酸乙酯后，其認(rèn)知功能得到改善，腦組織Nrf2及其靶基因表達(dá)增強(qiáng)(抗氧化能力提高)，神經(jīng)細(xì)胞的線粒體損傷減輕。

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廣西壯族自治區(qū)自然科學(xué)基資助項(xiàng)目(2014GXNSFAA118205)。

倪玉霞(E-mail: niyuxiafl@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.43.011

R743

A

1002-266X(2016)43-0038-03

2016-05-23)