孫月川，鄭 樺，劉 靜，王 琳，劉聚祥*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河北保定 071000；2.井陘縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河北石家莊 050300)

地黃多糖粉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

孫月川1，鄭 樺2，劉 靜1，王 琳1，劉聚祥1*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河北保定 071000；2.井陘縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河北石家莊 050300)

為建立地黃多糖粉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用Molish法聯(lián)合薄層色譜法進(jìn)行鑒別，通過苯酚硫酸法對多糖和高效液相色譜法對梓醇進(jìn)行含量測定。結(jié)果表明，Molish法顯色明顯，薄層色譜法斑點清晰；多糖在11.1 μg/mL～111 μg/mL的范圍內(nèi)，吸光度值與葡萄糖濃度呈良好的線性關(guān)系(R2=0.994 8)，平均加樣回收率為98.74%，RSD為2.61；梓醇在10.5 μg/mL～105 μg/mL的范圍內(nèi)，峰面積與進(jìn)樣濃度呈良好的線性關(guān)系(R2=0.999 2)，平均加樣回收率為99.09%，RSD為1.63。說明建立的方法簡便、準(zhǔn)確、可靠，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

地黃多糖；梓醇；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜法；高效液相色譜法

地黃是玄參科植物地黃(RehnanniaglutinosaLibosch) 的新鮮或干燥塊根，為我國四大懷藥之一，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，具有悠久的藥用歷史。根據(jù)炮制方法不同分為鮮地黃、生地黃和熟地黃。生地黃性味甘、寒，入心、肝、腎經(jīng)，為清熱涼血之品，有清熱生津，滋陰養(yǎng)血之功；熟地黃補血滋陰、益腎填髓；鮮地黃有清熱生津、涼血止血的功效。生地黃中的主要活性成分為糖類、環(huán)烯醚萜苷和氨基酸等，其中以地黃多糖和梓醇藥理作用廣泛[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，地黃多糖具有增強免疫力、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、促進(jìn)機體造血等作用[2-4]。梓醇具有神經(jīng)保護(hù)，抗腫瘤，降血糖等多種功效[5-7]。

地黃多糖粉是保定市冀農(nóng)動物藥業(yè)有限公司開發(fā)的新型中藥制劑，是以地黃多糖和梓醇的得率為指標(biāo)將生地黃經(jīng)回流提取，而后對濃縮液進(jìn)行噴霧干燥得到的中藥粉劑。獸醫(yī)臨床上主要用于提高動物免疫力。為保證臨床療效，有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，并為制定國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考，本研究參照2010版《中國藥典》中地黃藥材的定性定量方法，對地黃多糖粉主要成分地黃多糖和梓醇進(jìn)行鑒別和含量測定，建立地黃多糖粉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 材料

Waters高效液相色譜儀，Waters 2998光電二極陣列檢測器、Breeze色譜工作站，紫外分光光度計，島津UV-1750；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；HH-W420數(shù)顯三用恒溫水浴箱，金壇市醫(yī)療儀器廠；SP-1500實驗型噴霧干燥機，上海順儀科技公司；TS-NS系列提取濃縮機組，上海順儀科技公司；硅膠G板青島鼎康有限公司；生地黃產(chǎn)地為河南懷慶，地黃對照藥材，中國藥品生物制品檢定所，批號：121180-201005；梓醇標(biāo)準(zhǔn)品，中國食品藥品檢定所，批號：110808-201210；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，中國食品藥品檢定所 ，批號：110833-201311；乙腈、甲醇為色譜純，其他均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 定性鑒別 糖類的鑒別方法有：①Molish法。取地黃多糖粉0.1 g，加水10 mL，浸泡，取上清液1 mL，加入50 g/L的α-萘酚乙醇液(250 mL/L乙醇)2滴～3滴，搖勻后，沿試管壁緩緩加入濃硫酸1 mL。②薄層色譜法。取地黃多糖粉1 g，加水5 mL，作為供試品溶液。另取地黃對照藥材1 g，加水20 mL，超聲處理15 min，濾過，將濾液濃縮至2 mL，作為對照溶液。取輔料1 g，加水5 mL，作為陰性對照溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各5 μL，分別點樣于同一硅膠G薄層板上，以乙醇-濃氨試液-水(7∶1∶2)為展開劑，展開，取出晾干，噴以30 g/L茚三酮乙醇液，熱風(fēng)吹至斑點顯色清晰。

梓醇的鑒別方法：取地黃多糖粉2 g，加入甲醇20 mL，加熱回流提取1 h，濾過，濃縮至5 mL，作為供試品溶液。取地黃對照藥材，按上述相同的方法制備供試品溶液。另取梓醇對照品，加甲醇制成1 mg/mL的溶液，作為對照品溶液。按照薄層色譜法，吸取上述溶液各5 μL點樣于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(14∶6∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以硫酸甲醇液(1∶9)，105℃烤干至斑點顯色清晰。

1.2.2 含量測定

1.2.2.1 地黃總糖的含量測定 ①對照品溶液的制備。取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，干燥至恒重，取22.2 mg溶解在100 mL水中，配制成222 μg/mL的溶液。 ②供試品溶液的制備。取20 mg地黃多糖粉，溶解在100 mL的蒸餾水中，配制成200 μg/mL的溶液。精密吸取上述溶液1 mL于試管中加蒸餾水1 mL，加入50 g/L苯酚試劑1 mL，搖勻，迅速精密滴加濃硫酸5 mL，快速混勻，放5 min，沸水浴中加熱15 min，冷卻至室溫，在490 nm處測得吸光度。 ③標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備與線性關(guān)系的考察。精密吸取對照品溶液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置試管中，分別加蒸餾水至2.0 mL，精密加入50 g/L苯酚試液1 mL，搖勻，迅速精密滴加濃硫酸5 mL，快速混勻，放5 min，沸水浴中加熱15 min，冷卻至室溫。在490 nm處測得吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 ④穩(wěn)定性試驗。取同一供試品，在490 nm處測定吸光度，分別于0、30、60、90、120 min測定吸光度，計算RSD。 ⑤重復(fù)性試驗。取同一批樣品， 6份，按1.2.2.1.2的方法制備，分別測定吸光度，計算RSD。 ⑥精密度試驗。取樣，按②的方法制備供試品，重復(fù)測定6次，測定吸光度，計算RSD。 ⑦加樣回收試驗。加樣對照品的配制：取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10.6 mg，溶解在100 mL的容量瓶中，配成106 μg/mL的加樣對照品溶液。

回收率試驗：精密稱取同一批已知含量的樣品6份，配制成200 μg/mL的溶液，吸取0.5 mL，加入0.5 mL的蒸餾水，每份再精密加入對照品溶液(106 μg/mL)1 mL，加入50 g/L的苯酚試劑1 mL，搖勻，迅速精密滴加濃硫酸5 mL，快速混勻，放5 min，沸水浴中加熱15 min，冷卻至室溫。在490 nm處測得吸光度，計算回收率及RSD。

1.2.2.2 梓醇含量的測定 ①色譜條件。色譜柱：XBridgeTMC18( 5μm 4.6×250mm)；柱溫30℃；檢測波長210 nm；流動相：乙腈-水(1∶99)；進(jìn)樣體積20 μL；流速1 mL/min。②對照品溶液的制備。精密稱取梓醇對照品10.5 mg，置于100 mL容量瓶中，以流動相(10 mL/L乙腈)溶解稀釋至刻度，搖勻既得。③供試品溶液的制備。取樣品約100 mg，精密稱量，置于圓底燒瓶中，加入50 mL 600 mL/L的甲醇，稱定質(zhì)量，加熱回流提取1.5 h，冷卻后再次稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，繼續(xù)提取1.5 h。搖勻，過膜，量取濾液25 mL，減壓濃縮至干燥，殘渣用流動相(10 mL/L乙腈)溶解，轉(zhuǎn)移定容至10 mL量瓶中，搖勻，即得。④標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備與線性關(guān)系的考察。取②下的溶液，用流動相(10 mL/L乙腈)配成10.5，21，42，63，84，105 μg/mL的溶液，按①的色譜條件，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)Y，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)X，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。⑤穩(wěn)定性試驗。取同一供試品，按①項下色譜條件進(jìn)行測定，分別于0 、2 、4 、6 、8 、12 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，計算峰面積及RSD。⑥重復(fù)性試驗。取同一批次樣品，按③項下的方法制備6份，按①項下的色譜條件，分別測定，記錄色譜圖， 計算峰面積及RSD。⑦精密度試驗。取同一標(biāo)準(zhǔn)品溶液20 μL，按①項下的色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖， 計算峰面積及RSD。⑧加樣回收試驗。加樣對照品的配制：精密稱取梓醇對照品10.5 mg，置于100 mL的容量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，既得。

回收率試驗：精密稱取同一批已知含量的樣品6份，每份精密加入梓醇(105 μg/mL)10 mL，10 mL蒸餾水，30 mL的甲醇，按③項下的方法制備供試品，分別進(jìn)行測定，計算回收率及RSD。

1.2.2.3 樣品的含量測定 取3批樣品，按照上述方法對樣品中地黃總糖和梓醇進(jìn)行含量測定。

2 結(jié)果

2.1 定性鑒別結(jié)果

2.1.1 糖類的鑒別 ①Molish法：兩液交界面現(xiàn)紫紅色環(huán)，表明樣品中含有糖類。 ②薄層色譜法：供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的顏色斑點(圖1)。

2.1.2 梓醇的鑒別 供試品色譜中，在與對照品相應(yīng)的位置上，顯示出相同的顏色斑點，結(jié)果如圖2。

2.1.3 鑒別結(jié)果 考慮到梓醇為地黃特征成分和操作的簡單快速，本鑒別項將Molish法和梓醇的薄層鑒別列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項。

2.2 含量測定結(jié)果

2.2.1 地黃總糖的含量測定 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果表明，葡萄糖質(zhì)量濃度在11.1 μg/mL～ 111 μg/mL的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(圖3)。穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，測定得到0、30、60、90、120 min的吸光度，RSD為1.18%，說明供試品溶液在2 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

1.地黃多糖粉; 2.地黃對照藥材;3.陰性對照

1.Rehmanniapolysaccharide powder;2.Radix rehmanniae reference substance;3.Negative control

圖1 地黃多糖薄層色譜鑒別圖

Fig.1 Thin layer chromatogram ofRehmanniaglutinosapolysaccharide

1.梓醇標(biāo)準(zhǔn)品；2.地黃多糖粉；3.地黃對照藥材

1.Catalpol reference substance; 2.Rehmanniaglutinosapolysaccharide powder; 3.Radix rehmanniae reference substance

圖2 梓醇的薄層色譜鑒別圖

Fig.2 Thin layer chromatogram of catalpol

重復(fù)性試驗結(jié)果表明，測定得到6次重復(fù)性試驗的吸光度值，RSD為2.04%，說明該方法重復(fù)性良好。 精密度試驗結(jié)果表明，分別得到重復(fù)測定6次的吸光度值，RSD為0.09%，說明儀器精密度良好。

加樣回收試驗結(jié)果表明，平均加樣回收率為98.74%，RSD為2.61%(表1)。

2.2.2 梓醇含量測定結(jié)果 色譜條件的考察：在色譜條件下，樣品中的梓醇與其他峰均達(dá)到基線分離，梓醇峰保留時間為8.5 min(圖4)。

圖3 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 葡萄糖加樣回收試驗結(jié)果

Table 1 Recovery rates of standard addition of Glucose

樣品中質(zhì)量/μgSamplequantity加入質(zhì)量/μgAddedquantity測得的質(zhì)量/μgDetectedquantity回收率/%Recoveryrate平均回收率/%MeanrecoveryrateRSD/%10410620797.17101106210103.7710110620497.179310619697.179910620499.069410619898.1198.742.61

梓醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果表明，梓醇質(zhì)量濃度在10.5 μg/mL～105 μg/ml的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好(圖5)。

穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，測定得到0、2、4、6、8、12 h梓醇峰面積值，結(jié)果RSD為1.39%，說明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗結(jié)果表明，分別得到6次重復(fù)試驗的梓醇峰面積值，RSD為1.36%，說明該方法重復(fù)性良好。

精密度試驗結(jié)果表明，重復(fù)進(jìn)樣6次分別得到梓醇峰面積值，RSD為0.8%，說明儀器精密度良好。

加樣回收試驗結(jié)果表明，平均加樣回收率為99.09%，RSD為1.63%(表2)。

2.2.3 樣品含量測定結(jié)果 3批樣品的含量測定結(jié)果見表3。

圖4 地黃多糖粉的HPLC色譜圖

圖5 梓醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 討論

地黃中含有糖類、環(huán)烯醚萜苷類、氨基酸、微量元素等多種成分，使得多糖分離純化過程繁瑣、耗時較長，并且用薄層色譜法鑒別多糖也多采用酸水解，對組成多糖的單糖進(jìn)行鑒別，不具有特征性，較難用薄層快速鑒別[8-9]。一般快速鑒別糖類的方法如Molish也不具有專屬性，本研究采用Molish法結(jié)合茚三酮顯色鑒別地黃多糖，Molish法鑒別藥品中含有糖類，薄層法用以鑒別地黃的特征性。其中薄層色譜法的茚三酮顯色是鑒別氨基酸，氨基酸成分來自于地黃中微量的氨基酸，也有提取過程中多糖降解，產(chǎn)生的氨基酸類成分。此方法簡單快速，輔料對鑒別無干擾，但是屬于間接鑒別，考慮到地黃有特征成分梓醇，該項并不列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項。

表2 梓醇加樣回收試驗結(jié)果

Table 2 Recovery rate of standard addition of catalpol

樣品中質(zhì)量/μgSamplequantity加入質(zhì)量/μgAddedquantity測得的質(zhì)量/μgDetectedquantity回收率/%Recoveryrate平均回收率/%MeanrecoveryrateRSD/%11141050214297.9011221050216799.5211121050215399.1411061050212496.9511151050245899.33111310502181101.7199.091.63

表3 含量測定結(jié)果

Table 3 Result of content determination

樣品Samples總糖含量/%Thecontentoftotalpolysaccharides梓醇含量/%Thecontentofcatalpol2014110465.640.552014101764.240.542014100966.730.54

苯酚硫酸法是常用的測定多糖含量的方法，該方法簡單，靈敏度高，試驗時基本不受蛋白質(zhì)存在的影響，但也存在準(zhǔn)確性差和重現(xiàn)性低的問題[10-11]。試驗要嚴(yán)格控制顯色時間、溫度，同時用新的苯酚或者重蒸(避免氧化)，且保證所用器皿不含上次試驗滯留的顏色，可避免上述問題。

地黃藥材中梓醇是其特征成分，但梓醇不穩(wěn)定，在加工炮制過程中很容易流失，對其進(jìn)行鑒別和含量測定可有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。本試驗中梓醇的鑒別，參照《中國藥典》2010年版一部地黃項下的薄層色譜鑒別的方法[12]，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行試驗和調(diào)整，發(fā)現(xiàn)改用硫酸甲醇液(1∶9)顯色，斑點顯色更明顯，且有更好的分離效果，較糖類的鑒別，此法專屬性更強，更直接，可作為本品的鑒別方法。 HPLC法進(jìn)行含量測定梓醇時，考慮到梓醇極性較大，本試驗嘗試用40%、60%、80%、100%的甲醇提取梓醇，發(fā)現(xiàn)60%的甲醇提取梓醇，梓醇峰能達(dá)到較好的基線分離且峰型好峰面積大。

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Study on Quality Standard ofRehmanniaglutinosaPolysaccharide Powder

SUN Yue-chuan1,ZHENG Hua2,LIU Jing1,WANG Lin1,LIU Ju-xiang1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding，Hebei， 071000 ，China; 2.AnimalHealthInspectionInstituteofJingxingCounty,Shijiazhuang,Hebei,050300，China)

To establish the quality standard forRehmanniapolysaccharide powder, Molish method and TLC were used to identify. The content of polysaccharides in the powder was determined by phenol-sulfuric acid method and catalpol by HPLC.The coloration of Molish method was obvious.The TLC sports developed were fairly clear. Glucose showed a good linear relationship in the range of 11.1 μg/mL-111 μg/mL (R2=0.994 8),its average recovery rate was 98.74%,and RSD was 2.61%.Catalpol showed a good linear relationship in the range of 10.5 to 105 μg/mL (R2=0.999 2),its average recovery rate was 99.09%,and RSD was 1.17%.This method is simple,accurate and reliable.It can be used as the quality control method.

Rehmanniaglutinosapolysaccharide; catalpol;quality standard; TLC; HPLC

2015-11-05

河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系蛋雞產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊項目；石家莊市科技局項目(141490772A)

孫月川(1989-),女,河北唐山人,碩士研究生,主要從事新獸藥研發(fā)與殘留控制研究。*通訊作者

S853.7；S859.3

A

1007-5038(2016)05-0069-05