陶 立，閆鼎羽 ，李 軍*，馬春霞，陳澤祥，梁文匯，闕騰程 ，曾 鵬 ，李寶財(cái)，楊 威

(1.廣西獸醫(yī)研究所，廣西南寧 530001；2. 廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001；3. 廣西林業(yè)科學(xué)研究院，廣西南寧 530002；4. 廣西陸生野生動(dòng)物救護(hù)研究與疫源疫病監(jiān)測(cè)中心，廣西南寧 530028 )

一起穿山甲疫情的病原分析

陶 立1,2，閆鼎羽3*，李 軍1,2*，馬春霞1,2，陳澤祥1,2，梁文匯3，闕騰程4，曾 鵬4，李寶財(cái)3，楊 威1,2

(1.廣西獸醫(yī)研究所，廣西南寧 530001；2. 廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001；3. 廣西林業(yè)科學(xué)研究院，廣西南寧 530002；4. 廣西陸生野生動(dòng)物救護(hù)研究與疫源疫病監(jiān)測(cè)中心，廣西南寧 530028 )

為了查明一起人工養(yǎng)殖穿山甲疫情的致病原因，應(yīng)用病毒PCR檢測(cè)和細(xì)菌分離的方法對(duì)2只前后病死穿山甲進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)。病毒PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，未能從肺組織中檢測(cè)到流感病毒、副黏病毒和腺病毒核酸。細(xì)菌分離結(jié)果表明，從2只病死穿山甲肺中各分離到1株優(yōu)勢(shì)菌株。細(xì)菌的生化試驗(yàn)、16 S rRNA基因的序列分析表明，2株分離菌株均為摩氏摩根菌。小鼠的致病試驗(yàn)和分離菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，2株分離菌對(duì)小鼠有很強(qiáng)的致病作用,對(duì)新霉素、壯觀霉素、阿米卡星高度敏感。

穿山甲；摩氏摩根菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)

穿山甲為哺乳動(dòng)物，分類上屬于鱗甲目、穿山甲科，全球僅有7～8個(gè)種。產(chǎn)于我國(guó)的有中華穿山甲(Manispentadactyla)、印度穿山甲(M.crassicaudata)和馬來(lái)穿山甲(M.javanica)。印度穿山甲和馬來(lái)穿山甲在我國(guó)僅分布于云南的南部地區(qū)，而中華穿山甲廣泛分布于我國(guó)南方的大部分地區(qū)和長(zhǎng)江流域[1]。由于穿山甲具有重大的食用和藥用價(jià)值而慘遭獵殺，兼之自然棲息地的破壞，野生種群已瀕臨滅絕的危險(xiǎn)。穿山甲已被《中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書》列為易危級(jí)(Vu)，是國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，也是我國(guó)《野生藥材資源保護(hù)管理?xiàng)l例》規(guī)定保護(hù)的野生藥材物種之一[2]。保護(hù)野生穿山甲種群已刻不容緩，開(kāi)發(fā)穿山甲的經(jīng)濟(jì)價(jià)值還得走人工養(yǎng)殖的道路，穿山甲對(duì)環(huán)境條件的要求很高，人工養(yǎng)殖必須要解決3大技術(shù)問(wèn)題，即養(yǎng)殖技術(shù)、繁育技術(shù)和疾病防控技術(shù)。目前國(guó)內(nèi)人工養(yǎng)殖穿山甲成功的例子非常少見(jiàn)，多以失敗告終，究其原因是人們對(duì)穿山甲在人工養(yǎng)殖狀態(tài)下的生存需求(包括環(huán)境需求)還不甚了解[3]，而穿山甲人工繁育技術(shù)和疾病的防控技術(shù)更是未有過(guò)報(bào)道。

廣西林業(yè)科學(xué)院穿山甲養(yǎng)殖中心從救護(hù)和人工養(yǎng)殖試驗(yàn)出發(fā)，經(jīng)過(guò)多年的探索和實(shí)踐，在人工養(yǎng)殖技術(shù)方面取得了突破，從市場(chǎng)罰沒(méi)來(lái)的穿山甲在該養(yǎng)殖中心救護(hù)成活率目前達(dá)到40%以上。由于前期天氣持續(xù)高溫，該中心使用空調(diào)對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境溫度進(jìn)行調(diào)控，加上同期一些外來(lái)人員的調(diào)研驚動(dòng)，這些應(yīng)激因素可能導(dǎo)致了1只中華穿山甲和1只馬來(lái)穿山甲前后相繼發(fā)病，病程1個(gè)月左右，發(fā)病初期精神差，食欲不振，糞便稀少。使用青霉素后不見(jiàn)好轉(zhuǎn)，最終死亡。中華穿山甲死于8月上旬，馬來(lái)穿山甲死于8月中旬。剖檢2只穿山甲均見(jiàn)雙側(cè)肺大面積出血肝變，中華穿山甲肝臟還輕度黃染，小腸和大腸黏膜有輕微出血性炎癥，大腸內(nèi)糞便干結(jié)，其他臟器均未見(jiàn)肉眼可見(jiàn)病理變化。本文從2只人工飼養(yǎng)的病死穿山甲肺中分離到2株細(xì)菌，通過(guò)對(duì)小鼠的致病性試驗(yàn)，確定了其致病性。利用細(xì)菌生化試驗(yàn)和16 S rRNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)等方法對(duì)2株分離細(xì)菌進(jìn)行鑒定，鑒定為同一種細(xì)菌，即摩氏摩根菌，為穿山甲細(xì)菌病的防控技術(shù)研究提供了參考。穿山甲肺組織上清液經(jīng)流感病毒、腺病毒和副黏病毒特異性PCR檢測(cè)均為陰性，說(shuō)明這起穿山甲疫情為摩氏摩根菌感染所致。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 廣西林業(yè)科學(xué)研究院穿山甲人工養(yǎng)殖中心飼養(yǎng)的病死中華穿山甲和馬來(lái)穿山甲各1只。中華穿山甲為雄性，2014年1月26日接收，進(jìn)場(chǎng)時(shí)重量3.1 kg, 病前5.8 kg，存活18個(gè)月；馬來(lái)穿山甲為雌性，2015年3月17日接收，進(jìn)場(chǎng)時(shí)重量2.7 kg，病前3.8 kg，存活5個(gè)月。昆明系小鼠購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 試劑和儀器 麥康凱培養(yǎng)基，TSA、TSB購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，微量生化反應(yīng)管及藥敏試紙購(gòu)自杭州天和微生物制劑有限公司；病毒DNA/RNA提取試劑盒，分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)3、2×TaqPCR Master Mix購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；低溫臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)自Beckman公司；YY2 Ⅲ-8B 穩(wěn)壓穩(wěn)流型電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠；Pro Flex PCR System購(gòu)自Life Tech公司；721BR09310型凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad公司；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo forma公司。

1.2 方法

1.2.1 取樣 分別無(wú)菌取中華穿山甲和馬來(lái)穿山甲的肝、肺、腎及脾織制作觸片，革蘭染色鏡檢。

1.2.2 細(xì)菌的分離鑒定

1.2.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)和形態(tài)觀察 分別無(wú)菌取中華穿山甲和馬來(lái)穿山甲的肝、肺、腎及脾組織劃線接種麥康凱平板和TSA平板，37℃培養(yǎng)24 h觀察優(yōu)勢(shì)菌落的形態(tài)，取單個(gè)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌進(jìn)一步純化，革蘭染色觀察菌體的形態(tài)。純化的細(xì)菌接種TSB液體培養(yǎng)基，觀察其在液體中生長(zhǎng)狀況。

1.2.2.2 細(xì)菌分離株生化試驗(yàn) 將細(xì)菌分離株純化后按照參考文獻(xiàn)[4]的方法進(jìn)行。

1.2.2.3 細(xì)菌分離株小鼠致病性試驗(yàn) 將分離菌株的TSB 24 h培養(yǎng)液，用無(wú)菌TSB稀釋成濃度為1×108CFU/mL菌液，腹腔接種試驗(yàn)組小鼠0.4 mL/只，每組5只，對(duì)照組5只小鼠直接用無(wú)菌TSB液接種，接種量為0.4 mL/只，飼養(yǎng)7 d～10 d，觀察發(fā)病情況，對(duì)死亡小鼠剖檢觀察臟器的變化，并從中分離致病細(xì)菌，鑒定是否與原接種細(xì)菌一致。

1.2.2.4 細(xì)菌分離株16S rRNA基因測(cè)序和分析 挑取分離純化培養(yǎng)的單個(gè)菌落溶解到10μL滅菌生理鹽水中，充分振蕩混勻，取3 μL菌液作為模板，利用細(xì)菌16 S rRNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μL：模板3 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，2×TaqPCR Master Mix 26 μL，ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 60 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在15 g/L瓊脂糖凝膠電泳。膠回收，將PCR產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.2.5 藥物敏感性試驗(yàn) 采用藥敏試紙法，方法按李智紅等(2011年)報(bào)道的方法[5]進(jìn)行。

1.2.3 流感病毒、副黏病毒和腺病毒的PCR檢測(cè) 分別提取穿山甲肺組織的DNA和RNA，應(yīng)用RT-PCR和PCR檢測(cè)流感病毒、副黏病毒和腺病毒[6-7]。

2 結(jié)果

2.1 鏡檢結(jié)果

在2只穿山甲肺的組織中均發(fā)現(xiàn)有革蘭陰性的小桿菌；肝、腎和脾組織中未見(jiàn)有細(xì)菌。

2.2 細(xì)菌分離和鑒定結(jié)果

2.2.1 細(xì)菌分離株培養(yǎng)及形態(tài)特性 從2只穿山甲肺中各分離到1個(gè)優(yōu)勢(shì)菌株，經(jīng)純化后分別命名為Z菌株(分離自中華穿山甲)和G菌株(分離自馬來(lái)穿山甲)，2株細(xì)菌培養(yǎng)和形態(tài)特性相一致，在TSA平板上表現(xiàn)為圓形、灰白色隆起，表面濕潤(rùn)，中等大小的菌落，在麥康凱上能生長(zhǎng)，為棕色菌落，菌落中心顏色深，在TSB培養(yǎng)基中24 h后，培養(yǎng)基顏色變混濁，試管底有白色沉淀，搖動(dòng)呈絮狀。菌落涂片染色為革蘭陰性小桿菌。

2.2.2 Z和G菌株生化試驗(yàn)的結(jié)果 按照生化特性試驗(yàn)方法進(jìn)行生化鑒定，2種菌株結(jié)果一致，其生化特性符合東秀珠、蔡妙英主編《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[8]中摩氏摩根菌的生化特性相一致(表1)。

表1 病原分離株生化特性試驗(yàn)結(jié)果

Table 1 The biochemical test results of isolated strains

試驗(yàn)項(xiàng)目Test結(jié)果ResultsZG阿拉伯糖Arabinose--葡萄糖Glucose++麥芽糖Maltose--甘露糖Mannose++蔗糖Sucrose--硫化氫H2S--枸椽酸鹽Citrate--精氨酸水解酶Ornithinedecarboxylase--賴氨酸脫羧酶Lysinedecarboxylase--鳥(niǎo)氨酸脫羧酶Ornithinedecarboxylase++脲酶Urease++氧化酶Oxidase++過(guò)氧化氫酶Catalase++動(dòng)力Dynamic++吲哚Benzpyrole++MR++VP--山梨醇Sorbitol--甘露醇Mannitol--

注：“+”陽(yáng)性；“-”陰性。

Note:“+”Positive; “-” Negative.

2.2.3 Z和G菌株對(duì)小鼠致病試驗(yàn)結(jié)果 Z菌株組和G菌株組的小鼠各5只均于接種后18 h～24 h內(nèi)相繼全部死亡，死亡小鼠肺出血嚴(yán)重，肝腫脹、部分有出血。從死亡小鼠的肝、肺回收到接種菌，對(duì)照小鼠在試驗(yàn)期內(nèi)無(wú)異常。

2.2.4 Z和G菌株16 S rRNA序列分析 Z和G菌株經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得約1 400 bp的目的片段(圖1)。將PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明，2株分離菌株的16 S rRNA核苷酸序列同源性為98.7%，與GenBank上登錄的摩氏摩根菌(登錄號(hào)：AB210972，AF461011，HQ169114，CP004345，KF471511，KF611895)的核苷酸序列同源性達(dá)到98.1%～99.5%，序列比對(duì)結(jié)果表明分離到的2株病原菌均為摩氏摩根菌(表2)。

M. DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.G菌株; 2. F菌株; 3.陰性對(duì)照

M. DNA Marker DL 2 000;1.G strain; 2.F strain; 3.Negative control

圖1 細(xì)菌16 S rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1 PCR amplification results of 16 S rRNA of strains

表2 細(xì)菌16 S rRNA 序列核苷酸同源性比較

Table 2 Homology comparison of nucleotide sequences of 16 S rRNA

摩氏摩根菌菌株(登錄號(hào))Morganellamorganii(AcessionNo.)Z株/%ZstrainG株/%GstrainSSCT63(AB210972)98.498.2M567(AF461011)99.298.4KT(CP004345)99.598.1FUA1235(HQ169114)98.998.6Cucm(KF471511)99.298.4TMM13033(KF611895)98.998.6

2.2.5 分離菌株藥敏試驗(yàn)的結(jié)果 2株細(xì)菌藥敏結(jié)果均表現(xiàn)為對(duì)新霉素、壯觀霉素、阿米卡星高度敏感，對(duì)卡那霉素、頭孢曲松鈉中度敏感，對(duì)四環(huán)素、克拉霉素、羅紅霉素、先鋒Ⅵ、先鋒Ⅴ、慶大霉素、復(fù)方新諾明、諾氟沙星、氯霉素、恩諾沙星、青霉素G、紅霉素、頭孢噻肟、氨芐西林、強(qiáng)力霉素、鏈霉素、多黏菌素、林可霉素、頭孢夫辛、利福平完全耐藥。

2.3 肺組織中流感病毒、副黏病毒和腺病毒的PCR檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)的結(jié)果表明，2只病死穿山甲肺組織中流感病毒、副黏病毒和腺病毒均為陰性。

3 討論

摩氏摩根菌(Morganellamorganii)為腸桿菌科的細(xì)菌，廣泛存在于自然界環(huán)境以及人和動(dòng)物的糞便中，是一種重要的常見(jiàn)條件性致病菌，可感染人引起肺炎、尿道炎、結(jié)膜炎、關(guān)節(jié)炎，甚至敗血癥狀，也可引起傷口感染，還是醫(yī)院繼發(fā)性感染的重要病原[9],食用污染摩氏摩根菌的食物也可致人食物中毒[10]。摩氏摩根菌感染多種動(dòng)物發(fā)病并致死亡，表現(xiàn)的癥狀多為皮膚潰爛，肌肉出血以及肺炎、肝和腎臟的充血、出血等病變。國(guó)內(nèi)多見(jiàn)從發(fā)病的黃喉擬龜、鯉魚(yú)、大鯢、鱸魚(yú)、黿等[11-15]分離到該致病菌，是危害水生動(dòng)物重要的致病菌之一。趙耘等從患病的袋鼠肝臟中分離致摩氏摩根菌[16]，Zhao等從雞肝臟組織及分泌物中分離致病原菌，并通過(guò)生化試驗(yàn)和16 S rRNA序列檢測(cè)確定為摩氏摩根菌[17]。本研究從發(fā)病的穿山甲的肺中分離到摩氏摩根菌，無(wú)論從病原或還是表現(xiàn)出的臨床癥狀與相關(guān)報(bào)道基本一致。

隨著水產(chǎn)和畜牧業(yè)的快速發(fā)展，養(yǎng)殖方式發(fā)生了深刻的變革，同時(shí)臨床抗生素的大量濫用，導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性日趨嚴(yán)重。從已報(bào)道的摩氏摩根菌藥敏試驗(yàn)的情況來(lái)看，不同地區(qū)不同物種的分離株的耐藥情況并不一致，表現(xiàn)出復(fù)雜多變的特性。我們這次從穿山甲分離的2株摩氏摩根菌僅對(duì)新霉素、壯觀霉素、阿米卡星高度敏感，對(duì)四環(huán)素、先鋒Ⅵ、先鋒Ⅴ、慶大霉素、復(fù)方新諾明等絕大多數(shù)抗菌藥物耐藥。因此，臨床用藥必須以藥敏試驗(yàn)結(jié)果為指導(dǎo)，才會(huì)收到好的效果。本次疫情中我們及時(shí)將敏感藥物壯觀霉素拌入飼料中連喂3 d～5 d，疫情得到控制，至今沒(méi)有新的病例發(fā)生。

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Pathogenic Analysis of A Disease Epidemic in Pangolins

TAO Li1,2, YAN Ding-yu3, LI Jun1,2, MA Chun-xia1,2, CHEN Ze-xiang1,2, LIANG Wen-hui3,QUE Teng-cheng4,ZENG Peng4, LI Bao-cai3, YANG Wei1,2

(1.GuangxiVeterinaryResearchInstitute,Nanning，Guangxi,530001,China; 2.GuangxiKeyLaboratoryofAnimalVaccinesandNewTechnology,Nanning，Guangxi,530001,China; 3.GuangxiForestryAcademy,Nanning，Guangxi,530002,China; 4.GuangxiWildlifeRescueandAnimalEndemicDiseaseSurveillance,Nanning,Guangxi, 530028,China)

In order to find out the cause of disease epidemic in raised pangolins, samples from two dead pangolins were detected by bacterial isolation and PCR. Influenza virus, paramyxovirus or adenovirus virus could not be detected by PCR. Two bacterial strains were isolated from lungs of dead pangolins. Biochemical tests, 16 S rRNA sequence analysis of bacteria indicated that both isolates wereMorganellamorganii. Animal pathogenicity test suggested that the two isolates had strong pathogenic effect; while drug sensitivity test showed that both isolates were highly sensitive to neomycin, spectinomycin and amikacin.

pangolin;Morganellamorganii; isolation; drug sensitivity test

2015-10-29

國(guó)家林業(yè)局部門預(yù)算廣西項(xiàng)目(No.2015008)

陶 立(1964-)，男，廣西全州人，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物疫病防治研究。 *通訊作者

S858.9

B

1007-5038(2016)05-0133-04