胡興娟，沈 飚，王忠發(fā)，楊賽軍，徐君輝

(舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江舟山 316021)

沙門(mén)菌19個(gè)毒力島標(biāo)志性基因的PCR檢測(cè)

胡興娟，沈 飚，王忠發(fā)，楊賽軍，徐君輝

(舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江舟山 316021)

建立沙門(mén)菌19個(gè)毒力島標(biāo)志性基因檢測(cè)方法，了解沙門(mén)菌中毒力島的分布情況。通過(guò)比對(duì)驗(yàn)證挑選出45個(gè)毒力基因作為19個(gè)毒力島標(biāo)志性基因，建立PCR檢測(cè)方法，并對(duì)傷寒、腸炎、鼠傷寒及貝坎道夫沙門(mén)菌進(jìn)行分布情況研究。19個(gè)毒力島上45個(gè)標(biāo)志性基因分別在傷寒、腸炎、鼠傷寒及貝坎道夫沙門(mén)菌得到驗(yàn)證， PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物一致，電泳條帶典型，無(wú)非特異擴(kuò)增條帶及雜帶出現(xiàn)。45個(gè)標(biāo)志性基因在傷寒、腸炎、鼠傷寒及貝坎道夫沙門(mén)菌檢出率分別為75.56%、75.56%、66.67%和42.22%。本研究建立的45個(gè)毒力島標(biāo)志性基因檢測(cè)方法具有結(jié)果準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單快速、費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)，適用于沙門(mén)菌毒力島研究及不同來(lái)源的沙門(mén)菌致病性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

沙門(mén)菌；毒力島；標(biāo)志性基因；PCR檢測(cè)

細(xì)菌毒力島(pathogenicity island)是染色體、質(zhì)粒上成簇分布的編碼毒力相關(guān)基因的特定區(qū)域[1]。毒力島的發(fā)現(xiàn)使我們認(rèn)識(shí)到細(xì)菌的毒力比我們想象的要復(fù)雜，改變了以往認(rèn)為細(xì)菌的毒力是單因素的概念。目前，已知許多病原細(xì)菌，如大腸埃希菌[2]、沙門(mén)菌[3]、金黃色葡萄球菌[4]等都存在毒力島，而且一種病原細(xì)菌往往具有1個(gè)或多個(gè)毒力島。沙門(mén)菌的致病性也與其毒力島(Salmonellapathogenicity island，SPI)密切相關(guān)[5]，毒力島在沙門(mén)菌入侵腸道上皮細(xì)胞過(guò)程中扮演重要角色。研究發(fā)現(xiàn)，沙門(mén)菌至少有19個(gè)毒力島，每個(gè)毒力島上分布的毒力基因數(shù)量不等，其中 SPI-1上分布著20個(gè)，SPI-2、SPI-3和SPI-6均為8個(gè)，SPI-7和SPI-11均為6個(gè)，SPI-5有4個(gè)，SPI-4和SPI-10均為3個(gè)，其余的SPI均為2個(gè)[6]。國(guó)內(nèi)對(duì)沙門(mén)菌毒力島及其標(biāo)志性基因檢測(cè)研究進(jìn)展較慢，多數(shù)局限于SPI-1～SPI-5，每個(gè)毒力島的標(biāo)志性基因多僅為1個(gè)[7-8]。

本研究根據(jù)Suez J等[6]報(bào)道的沙門(mén)菌19個(gè)SPI上的86個(gè)毒力基因，通過(guò)比對(duì)驗(yàn)證挑選出45個(gè)毒力基因作為19個(gè)毒力島標(biāo)志性基因，建立檢測(cè)方法，并分別在傷寒、腸炎、鼠傷寒及貝坎道夫沙門(mén)菌進(jìn)行分布情況研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 傷寒沙門(mén)菌、腸炎沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌均由寧波市疾控中心贈(zèng)予；貝坎道夫沙門(mén)菌由本單位菌種室分離；傷寒沙門(mén)菌、腸炎沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌來(lái)源于病人的血液與糞便樣本，貝坎道夫沙門(mén)菌來(lái)源于冷凍水產(chǎn)品樣本。

1.1.2 主要試劑及儀器 DNA擴(kuò)增試劑盒RR045A、DNA Marker DL 1 000和瓊脂糖購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；Veriti普通PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；凝膠成像儀、電泳儀及小型電泳槽購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；大型電泳儀及電泳槽Tanon EPS-100購(gòu)自天能公司；高速離心機(jī)LEGEND Micro 21R購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 sseL、mgtC、siiE與sopB的引物序列分別參考陳飛等[9]報(bào)道的序列，其余引物序列的設(shè)計(jì)選擇多重耐藥傷寒沙門(mén)菌株CT18(NC-003198)和鼠傷寒沙門(mén)菌LT2(NC-003197)上的靶基因序列，引物設(shè)計(jì)選用美國(guó)IDTDNA公司網(wǎng)上設(shè)計(jì)軟件(http://www.idtdna.com/primerquest/Home/Index)，軟件提供的引物序列經(jīng)Blast比對(duì)后確認(rèn)最合適的一對(duì)備用并提交寶生物工程(大連)有限公司合成，19個(gè)SPI上的45對(duì)標(biāo)志性毒力基因名稱和引物序列見(jiàn)表1。

表1 沙門(mén)菌毒力島上標(biāo)志性毒力基因的靶基因與引物序列

Table 1 Target genes and primers used forSalmonellapathogenicity islands

毒力位點(diǎn)Virulenceloci基因名Gene位點(diǎn)標(biāo)記Locustag引物序列(5'-3')Primersequences產(chǎn)物長(zhǎng)度/bpLengthSPI-1HilASTM2876GACAGAGCTGGACCACAATAAGACA,GAGCGTAATTCATCGCCTAAAC312SPI-1invASTM2896CCGATTTGAAGGCCGGTATTA,GAGATCGCCAATCAGTCCTAAC587SPI-1sipDSTM2883ACAGCTATCTGGGCGTTTATG,CGACTGCCAGGCTTGATATT437SPI-1prgHSTM2874CTTCAGGYCAACTCCCTGATATAC,CCCTTGAGCCAGTCATCTTT961SPI-2ssaBSTM1393GATATCAGGGCCGAAGGTAAT,GCAAGTTAAAGCCAGGTGTTT294SPI-2sseCSTM1400ATGAATCGAATTCACAGTAA,TTAAGCGCGATAGCCAGCTA1445SPI-2ssrBSTM1391CTCATTCTTCGGGCACAGTTA,CCTTATTACCCTGGCCTCATTT558SPI-2sseLSTM2287TGTTTAGCGCCGTAGAGAAC,CGCGGAACCTGCCATATAA269SPI-3marTSTM3759CGTCGTCTCACAACAAACATTC,CTGACAAATCAATGCCGTAACC556SPI-3misLSTM3757CACTGACCTGACGCTGAATAG,GACTTGACCACGGGAATGATAG946SPI-3mgtCSTM3764AAAGACAATGGCGTCAACGTATGG,TTCTTTATAGCCCTGTTCCTGAGC500SPI-4siiESTM4261TTTTTTGCCGATCAAAATTCTGTA,TATACTATCATCTTTGCTACCGCT750SPI-4siiDSTM4260GTCAGGGCGTTATCACTACTAAA,TTCACATCGGCCAGCATAG826SPI-4siiFSTM4262CGCGGTGAACTCTGTTATGT,CATCCTGCCTTGCTGTGATA355SPI-5pipBSTM1088CCTGTGGTGGAGTAAGAAGAAG,GTCAGTTAAGTCTGAGCCGAATA599SPI-5sopBSTM1091TCACTAAAAACCCAGGAGGCTTTT,CGCCATCTTTATTGCGGATTTTTA1000SPI-6pagNSTM0306TTCCAGCTTCCAGTACGTTTAG,GCCTTTGTGTCTGCATCATAAG440SPI-6safBSTM0300GGTGATGCCGCCTCTATTT,CGTAGTGGAACGGATGACTTT476SPI-7pilVSTY4550CATCAGCGACCACAACTACA,GGACCATTACTGACCAGACTTAC544SPI-7vexASTY4655AAACTAAGCGCTCCCGATAC,CAGTCGCGCAGTGAAATAATG504SPI-7tviESTY4656GCGGCCTGAAAGTAGAAGAA,ACCCGAAACACCCTCAATAAA959SPI-8STY3281STY3281CGGAAAGTGAGTTCATTGATTTCT,TCCTTGAGATTCTCTCCATTCTTT209SPI-8STY3283STY3283CCTTGAAGATTATACAGAAGATGAG,TAGCTCTTCAATAACTCCTTCAG211SPI-9bapASTM2689TAAGCGTCGGACTTGGTAATG,CGTTCTTCAGCGTGTAGGTATAG543SPI-9STY2878STY2878TTTCTCATTCTCGGCATCTGG,CAATCGTCGTGACCTGGATATT685SPI-10sefASTY4836aTCAGGCAGCGGTTACTATTG,CGTAGAAGGTCGCAGTGAAA385SPI-10STY4826STY4826TGTTTCACTGTCCGTTCTGC,CTGTAGCAGCCCTGTACTTTAC220SPI-11pagCSTY1246TCTGTTGAGCCTGAAGGTATTC,CGACGTTGAAGCCGTTTATTT313SPI-11envFSTY1240TAGCGCCTGTGATAACGATAAA,ATCCGGCAATAGAACCATCC577SPI-12sspH2STM2241GGAGTGCATCTGGACGATTT,GACCTGATTCTCCCACGTTAAG488SPI-12oafASTM2232CGAGTGACTGGAACCAAAGA,CAAGCATAGAGCCAGAGTAGAG510SPI-13STM3118STM3118GGATTGCGAGGACAGCTAAA,CAGTGACTATCCAGTGCGTATC741SPI-13STM3121STM3121CGTCGTACTTTCAAGCGGGCTTATC,CTCTGCCGACACAAGGTTAATG381SPI-14STM0854STM0854ATCCTTCTGTTGACGGTATCAC,GTTTATCCACCATTTGCCCTTC240SPI-14STM0859STM0859GTTACGTAGCGATATGCAGGAG,GCAGCAGAGTGAGGCATTAT504SPI-15STY3188STY3188GCTGAATGGTGTGCTGAAATC,GGTGTTGCCATCTCTGGATAA706SPI-15STY3191STY3191TGACTACAGGCGGAGGATTA,AGACTCAGAGAAGGACAGAGAG356SPI-16STM0557STM0557GACAGGGCGAAACATAACAAAC,CCCATGTCCCAGATGTAATTGA475SPI-16gtrASTY0607TGTTATCGCCGTATCGTTCAG,TTCGCATCCCTAAAGACAATGA234SPI-17STY2629STY2629CTTTGGAGTGAGTCTGGCTATT,GCGCCAAGTAYTGGGATTATTG425SPI-17STY2631STY2631CGAGCTCAAACTCCCACAA,CTTTGAAGGTGGCGATGATTTC213SPI-18hlyESTY1498GGCGTGATTGAAGGGAAATTG,GCGTCTTCTTACCGTGTCTT289SPI-18taiASTY1499GAACCMAAACCTGTTGTGAAAG,AGCGGAAATAARCCGGTAAA281SPI-19SEN1003SEN1003CTGCACACGGCCACTTATTA,TGGACTTCCACCTTCATTTCC485SPI-19icmFSEN1004GCGTAGTCCAGATGAGACATTAG,GCGGCCAGATAGACGATATTT724

1.2.2 PCR檢測(cè)方法

1.2.2.1 模板制備 取平板新鮮分離純菌，懸浮于100 μL DNA提取液中混勻后置沸水中5 min，12 000 r/min高速離心5 min,取上清為DNA模板，置4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為25 μL：RR045A擴(kuò)增反應(yīng)液12.5 μL，20 μmol/L上游引物和下游引物各0.5 μL，模板1 μL，雙蒸水10.5 μL，混合后離心置PCR儀上擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：98℃ 10 s，55℃ 5 s，72℃ 10 s，30個(gè)循環(huán)；72℃1 min，4℃結(jié)束反應(yīng)。

1.2.2.3 PCR產(chǎn)物分析 取上述PCR產(chǎn)物5 μL加入到20 g/L瓊脂糖凝膠上90V 60 min電泳，電泳后凝膠成像儀鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物分子質(zhì)量判斷參照DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品DL1 000。以DL1 000提供的每條電泳條帶的亮度及相對(duì)應(yīng)的濃度(DNA分子質(zhì)量為400 bp的條帶其相對(duì)應(yīng)的濃度約150 ng，其余條帶的其相對(duì)應(yīng)濃度約50 ng)為參比標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判各個(gè)定毒力基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物強(qiáng)度：亮度≥150 ng為+++～++++；50 ng<亮度<150 ng的為++；亮度在50 ng左右的為+。

2 結(jié)果

2.1 45個(gè)標(biāo)志性毒力基因在4株沙門(mén)菌中檢測(cè)結(jié)果

由表2可知，45個(gè)標(biāo)志性毒力基因檢測(cè)結(jié)果，在傷寒沙門(mén)菌的陽(yáng)性率75.56%(34/45)，腸炎沙門(mén)菌的陽(yáng)性率75.56%(34/45)，鼠傷寒沙門(mén)菌的陽(yáng)性率66.67%(30/45)，貝坎道夫沙門(mén)菌的陽(yáng)性率42.22%(19/45)。

表2 4種沙門(mén)菌中19個(gè)毒力島分布情況

Table 2 Distribution of 19 pathogenicity islands across 4 species ofSalmonella

毒力位點(diǎn)Virulenceloci基因名Gene/Locustag基因描述Genedescription傷寒沙門(mén)菌S.typhi腸炎沙門(mén)菌S.enteritidis鼠傷寒沙門(mén)菌S.typhimurium貝坎道夫沙門(mén)菌S.bergedorfSPI-1hilA/STM2876轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白Transcriptionalregulator+++++++++++++SPI-1invA/STM2896侵入蛋白Invasionprotein++++++++++++SPI-1sipD/STM2883細(xì)胞侵入蛋白Cellinvasionprotein++++++++++++SPI-1prgH/STM2874分泌系統(tǒng)蛋白Secretionsystemprotein++++++++++++++SPI-2ssaB/STM1393分泌系統(tǒng)裝配蛋白Secretionsystemappa-ratusprotein++++++++++SPI-2sseC/STM1400分泌效應(yīng)蛋白Secretedeffectorprotein+++++++++++++SPI-2ssrB/STM1391轉(zhuǎn)錄激活蛋白Secretionsystemtranscrip-tonalactivator+++++++++++++++SPI-2sseL/STM2287去泛素化酶Deubiquitinase+++++++++++SPI-3marT/STM3759轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白Transcriptionalregulator+++++++++++++SPI-3misL/STM3757自動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Autotransportedprotein+++++++++++++SPI-3mgtC/STM3764mgtC蛋白ProteinmgtC++++++++++++SPI-4siiD/STM4260膜滲透酶Membranepermease++++++++++++-SPI-4siiE/STM4261假定蛋白Hypotheticalprotein++++++++++++-SPI-4siiF/STM4262細(xì)菌素運(yùn)輸?shù)鞍譈acteriocin/lantibioticABCtransporter+++++++++++++SPI-5pipB/STM1088毒力島蛋白BPathogenicityisland-encodedproteinB++++++++++++++SPI-5sopB/STM1091肌醇磷酸鹽酶Inositolphosphatephospha-taseSopB+++++++++++++SPI-6pagN/STM0306黏附素Adhesin/invasinproteinPagN+++++++++++++SPI-6safB/STM0300菌毛裝配伴侶蛋白Bacteriocin/lantibioticABCtransporter++++++++++++-SPI-7pilV/STY4550纖毛尖端黏附素Prepilin+++---SPI-7vexA/STY4655Vi輸出蛋白ViPolysaccharideexporterprotein++++---SPI-7TviE/STY4656內(nèi)毒素生物合成蛋白ViPolysaccharidebio-synthesisprotein++++---SPI-8STY3281/STY3281細(xì)菌素免疫蛋白Bacteriocinimmunitypro-tein++---SPI-8STY3283/STY3283細(xì)菌素免疫蛋白Bacteriocinimmunitypro-tein++---SPI-9bapA/STM2689偽蛋白Pseudo++++++++++++++SPI-9STY2878/STY2878Ⅰ型分泌系統(tǒng)蛋白TypeIsecretionsystemprotein+++++++++++++++SPI-10sefA/STY4836a主要纖毛蛋白亞族MajorpilussubunitSafA++++++--SPI-10STY4826/STY4826噬菌體調(diào)控蛋白Bacteriophagegeneregula-toryprotein++---

續(xù)表2

毒力位點(diǎn)Virulenceloci基因名Gene/Locustag基因描述Genedescription傷寒沙門(mén)菌S.typhi腸炎沙門(mén)菌S.enteritidis鼠傷寒沙門(mén)菌S.typhimurium貝坎道夫沙門(mén)菌S.bergedorfSPI-11pagC/STM1246毒性膜蛋白Virulencemembraneprotein-+++++++++SPI-11envF/STM1240脂蛋白Lipoprotein-++++++++++SPI-12sspH2/STM2241泛素蛋白連接酶E3ubiquitin-proteinligase++++++++++++-SPI-12oafA/STM2232O抗原乙酰轉(zhuǎn)移酶O-antigenacetylase--+++-SPI-13STM3118/STM3118乙酰輔酶A水解酶Acetyl-CoAhydrolase-++++++++-SPI-13STM3121/STM3121LYs轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白LysRfamilytranscrip-tionalregulator-++++++-SPI-14STM0854/STM0854細(xì)胞質(zhì)蛋白Cytoplasmicprotein-+++++++-SPI-14STM0859/STM0859LYs轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白LysRfamilytranscrip-tionalregulator-++++++++-SPI-15STY3188/STY3188假定蛋白Hypotheticalprotein----SPI-15STY3191/STY3191假定蛋白Hypotheticalprotein----SPI-16STM0557/STM0557內(nèi)膜蛋白Innermembraneprotein++++++++++++-SPI-16gtrA/STY0607葡萄糖移位酶Bactoprenol-linkedglucosetranslocase++++++-SPI-17STY2629/STY2629脂多糖修飾酶Lipopolysaccharidemodifica-tionacyltransferase++++++++--SPI-17STY2631/STY2631偽基因Pseudo++++--SPI-18taiA/STY1499假定蛋白Hypotheticalprotein++---SPI-18hlyE/STY1498溶血素EHemolysinHlyE+++---SPI-19SEN1003/SEN1003假定蛋白Hypotheticalprotein-++++--SPI-19icmF/SEN1004Ⅵ型分泌蛋白TypeVIsecretionproteinIc-mF-++++--

2.2 45個(gè)標(biāo)志性毒力基因PCR擴(kuò)增效果

19個(gè)毒力島上45個(gè)標(biāo)志性基因分別在傷寒、腸炎、鼠傷寒及貝坎道夫沙門(mén)菌得到驗(yàn)證，由表2可知，上述45個(gè)標(biāo)志性毒力基因通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得強(qiáng)陽(yáng)性結(jié)果(+++～++++)占82.22%(37/45)，獲得陽(yáng)性結(jié)果(+～++)的占13.33%(6/45)。PCR擴(kuò)增獲得陰性結(jié)果占4.44%(2/45)。由圖1、圖2可見(jiàn)，每個(gè)標(biāo)志性基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分子質(zhì)量與預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物一致，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶清晰，無(wú)非特異擴(kuò)增條帶及雜帶出現(xiàn)。

2.3 陽(yáng)性標(biāo)志性基因在各個(gè)毒力島上的分布

分布在SPI-1、2、3、4、5和9上的17個(gè)標(biāo)志性基因?qū)?、腸炎、鼠傷寒與貝坎道夫4株沙門(mén)菌檢查結(jié)果均為陽(yáng)性，它們分別是hilA 、invA、sipD、prgH、ssaB、sseC、ssrB 、sseL、marT、misL、mgtC、siiF、pipB、sopB、pagN、bapA 和STY2878。分布在SPI-15上的STY3188和STY3191兩個(gè)標(biāo)志性基因?qū)?、腸炎、鼠傷寒與貝坎道夫4株沙門(mén)菌檢查結(jié)果均為陰性。分布在SPI-7、8、10和18上的pilV、vexA、tviE、safA、taiA、hlyE、STY3281和STY3283等8個(gè)標(biāo)志性基因僅在傷寒沙門(mén)菌中獲得陽(yáng)性結(jié)果。分布在SPI-11、12、13、14和19上的STM3118、STM3121、STM0854、STM0859、SEN1003、pagC、oafA、EnvF和icmF等9個(gè)標(biāo)志性基因僅在非傷寒沙門(mén)菌(腸炎沙門(mén)菌或鼠傷寒沙門(mén)菌等)中獲得陽(yáng)性結(jié)果，其中SEN1003、icmF僅在腸炎沙門(mén)菌而oafA僅在鼠傷寒沙門(mén)菌上獲得陽(yáng)性結(jié)果(表2)。

3 討論

細(xì)菌毒力島是一組編碼細(xì)菌毒力的基因簇，其所編碼的基因產(chǎn)物多為分泌性蛋白、細(xì)胞表面蛋白、分泌系統(tǒng)(如Ⅲ型分泌系統(tǒng))、信息傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)系統(tǒng)。沙門(mén)菌是全球上引起食源性腹瀉最常見(jiàn)的病原菌之一。全球每年約有由沙門(mén)菌引起的腸胃炎病例938萬(wàn)例，甚至每年有15萬(wàn)人死于沙門(mén)菌感染[10]。我國(guó)沙門(mén)菌食物中毒多年來(lái)一直居細(xì)菌性食物中毒的首位。其中傷寒沙門(mén)菌是引起臨床腸熱癥的主要血清型，腸炎沙門(mén)菌和鼠傷寒沙門(mén)菌是引起急性胃腸炎及食物中毒的主要血清型[11]，沙門(mén)菌的相關(guān)毒力基因在多種血清型中廣泛存在，但其存在與否與菌株的血清型無(wú)關(guān)[12]。研究發(fā)現(xiàn)沙門(mén)菌至少有19個(gè)毒力島(SPI)，其上分布著85個(gè)毒力基因，這些基因控制或編碼沙門(mén)菌的毒力因子(如菌毛、毒素 、酶等)，研究和檢測(cè)這些毒力基因在了解沙門(mén)菌的進(jìn)化規(guī)律、闡述致病機(jī)理、認(rèn)識(shí)和預(yù)測(cè)新發(fā)沙門(mén)菌病和食品安全評(píng)估等方面有著重要的意義。

A.擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度≤485 bp;B.擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度>485 bp;M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000；1～45.STY3188、STY3191、STY3281、STY3283、STY2631、STY4826、gtrA、STY0854、ssel、taiA、hlyE、ssaB、hilA、pagC、siiF、STY3121、sefA、STY2629、sipD、pagN、STN0557、safB、SEN1003、ssph2、mgtC、vexA、STM0859、oafA、bapA、pilV、marT、ssrB、EnvF、invA、pipB、STY2878、IcmF、STM3118、siiE、siiD、misL、tviE、prgH、sopB、sseC

A.Length of PCR products not more than 485 bp;B.Length of PCR products more than 485 bp; M.DNA Marker DL1 000；1-45.STY3188,STY3191,STY3281,STY3283,STY2631,STY4826,gtrA,STY0854,ssel,taiA,hlyE,ssaB,hilA,pagC,siiF,STY3121,sefA,STY2629,sipD,pagN,STN0557,safB,SEN1003,ssph2,mgtC,vexA,STM0859,oafA,bapA,pilV,marT,ssrB,EnvF,invA,pipB,STY2878,IcmF,STM3118,siiE,siiD,misL,tviE,prgH,sopB,sseC

圖1 45個(gè)標(biāo)志性基因PCR產(chǎn)物電泳圖

Fig.1 Electrophoresis of PCR products of 45 iconic genes

在已發(fā)現(xiàn)的19個(gè)SPI中以SPI-l和SPI-2與致病性最為密切相關(guān)，它們各自編碼不同Ⅲ型分泌系統(tǒng)，在感染的不同階段都發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。SPI-3和SPI-4對(duì)沙門(mén)菌在膜性結(jié)構(gòu)內(nèi)存活和黏附在極化細(xì)胞的表面發(fā)揮重要作用。SPI-5編碼的效應(yīng)蛋白通過(guò)SPI-1和SPI-2編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌[14]。其余的毒力島是近年來(lái)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的，各個(gè)毒力島上的毒力基因與其編碼的蛋白已在表2中逐一介紹。本文在85個(gè)毒力基因中挑選45個(gè)作為19個(gè)SPI的標(biāo)志性基因，通過(guò)對(duì)傷寒、腸炎、鼠傷寒及貝坎道夫4株沙門(mén)菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，除了STY3188和STY3191兩個(gè)標(biāo)志性基因陰性外，其余43個(gè)標(biāo)志性基因均獲陽(yáng)性結(jié)果，但不同菌株間的陽(yáng)性量具有一定的差異，尤其是來(lái)源于病人的傷寒、腸炎和鼠傷寒沙門(mén)菌攜帶的毒力基因數(shù)量明顯多于來(lái)源于食品的貝坎道夫沙門(mén)菌。對(duì)陰性的2個(gè)標(biāo)志性基因(STY3188和STY3191)進(jìn)行全序列Blast比對(duì)，結(jié)果顯示，這2個(gè)基因序列僅存在于多重耐藥的傷寒沙門(mén)菌菌株CT18(NC-003198)以及少數(shù)大腸埃希菌和志賀菌的染色體上。

國(guó)內(nèi)對(duì)沙門(mén)菌毒力島標(biāo)志性基因檢測(cè)方法存在以下不足：①僅局限于SPI-1～SPI-5的范圍之內(nèi)且每個(gè)毒力島僅提供一個(gè)標(biāo)志性基因，造成選擇范圍狹窄。②各個(gè)標(biāo)志性毒力基因的PCR擴(kuò)增程序不同，造成工作效率低下。本文研究針對(duì)上述狀況作了以下的補(bǔ)充與優(yōu)化：①SPI從原來(lái)的5個(gè)擴(kuò)展到19個(gè)，SPI上的標(biāo)志性基因檢測(cè)也從5個(gè)增加到45個(gè)，為今后SPI的深入研究提供了參考依據(jù)。②45個(gè)標(biāo)志性基因的檢測(cè)可通用于一個(gè)PCR程序，簡(jiǎn)化了試驗(yàn)操作與基因擴(kuò)增步驟。③明顯提高檢測(cè)效率，從模板制備、試劑配制、基因擴(kuò)增及產(chǎn)物電泳分析整個(gè)過(guò)程可在1 h左右完成，為大規(guī)模的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)提供了一個(gè)簡(jiǎn)單快捷、高效準(zhǔn)確的檢測(cè)平臺(tái)。④所有標(biāo)志性基因的PCR產(chǎn)物在成像儀下觀察，背景清晰,結(jié)果準(zhǔn)確,特異條帶明亮典型,未見(jiàn)有非特異性條帶、雜帶和拖帶現(xiàn)象。

本文為國(guó)內(nèi)沙門(mén)菌毒力島研究的同行提供了沙門(mén)菌19個(gè)毒力島標(biāo)志性基因的簡(jiǎn)單快捷、準(zhǔn)確高效的檢測(cè)方法，可為不同來(lái)源和不同血清型的沙門(mén)菌致病性及潛在風(fēng)險(xiǎn)研究提供一種簡(jiǎn)單可行且比較科學(xué)的研究方法，對(duì)評(píng)估該沙門(mén)菌可能引起流行強(qiáng)度和致病風(fēng)險(xiǎn)具有較大的應(yīng)用價(jià)值。

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PCR Detection of Iconic Genes in 19SalmonellaPathogenicity Islands

HU Xing-juan,SHEN Biao,WANG Zhong-fa,YANG Sai-jun，Xu Jun-hui

(ZhoushanEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Zhoushan,Zhejiang,316000,China)

To develop a PCR method for detection ofSalmonellapathogenicity island genes and to investigate the distribution of pathogenicity islands inSalmonella,by comparing selected 45 virulence genes as the iconic genes of 19 pathogenicity islands,PCR assay was established for detectingS.typhi,S.enteritidis,S.typhimuriumandS.bergedorf.45 iconic virulence genes distributed among the 19 pathogenicity islands were validated inS.typhi,S.enteritidis,S.typhimuriumandS.bergedorf.The length of amplified products were the same as expected and bands of which were rather typical and clear.The detection rates of 45 virulence genes were 75.56%,75.56%,66.67% and 42.22%,respectively,inS.typhi,S.enteritidis,S.typhimuriumandS.bergedorf.The PCR method which was accurate,rapid and low-cost was available for studyingSalmonellapathogenicity islands and evaluating the relative risk.

Salmonella； pathogenicity island；iconic gene；PCR detection

2015-10-14

國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014IK278)；浙江省分析測(cè)試科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014C37108)

胡興娟(1981-)，女，浙江紹興人，工程師，主要從事微生物與食品安全研究。

S852.612

A

1007-5038(2016)05-0020-06