周傳鐸 ， 任連權 ， 趙 然 ， 張 迪 ， 周雅楠 ， 李曉曉 ， 林德貴

(1.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院 ， 北京海淀100193 ； 2.北京市公安局刑偵總隊警犬技術支隊 ，北京大興102614 ； 3.天津市獸藥飼料監(jiān)察所 ， 天津北辰300402)

北京地區(qū)警犬皮膚葡萄球菌分離鑒定及耐藥性試驗

周傳鐸1，2， 任連權3， 趙 然2， 張 迪1， 周雅楠1， 李曉曉1， 林德貴1

(1.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院 ， 北京海淀100193 ； 2.北京市公安局刑偵總隊警犬技術支隊 ，北京大興102614 ； 3.天津市獸藥飼料監(jiān)察所 ， 天津北辰300402)

犬膿皮病，又稱為犬細菌性皮膚病或犬細菌性毛囊炎，為由細菌引起的犬皮膚及其相關結構的感染[1]，系犬常見病之一。該病具有發(fā)病率高、療程長、易復發(fā)的特點，加上日益嚴重的細菌耐藥問題，使得該病的治療愈發(fā)困難。而葡萄球菌被認為是引起人與動物化膿感染的主要的病原菌之一[1]。本試驗對北京地區(qū)警犬膿皮病病例及健康警犬體表皮膚的葡萄球菌進行分離、鑒定及藥物敏感性試驗，為警犬皮膚病防治提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料選擇 (1)2014年10月-2015年01月，北京地區(qū)新發(fā)的警犬膿皮病病例18例；(2)北京地區(qū)健康警犬50頭(體表無化膿感染病灶，其他器官或系統(tǒng)無明顯病變)，其中德國牧羊犬、史賓格犬、拉布拉多犬、羅威納犬、馬里努阿犬各10只，雌雄各半，年齡平均分布。

1.2 培養(yǎng)基及試劑 細菌培養(yǎng)所用各種培養(yǎng)基，購自北京奧博星生物技術有限責任公司；藥敏試紙片，分別購自賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司及北京天壇生物科技有限公司；培養(yǎng)基及其他試劑的配制均按產品說明或常規(guī)方法配制；標準菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923、ATCC29213由中國農業(yè)大學藥理實驗室提供；DNA Marker，購自天跟生化科技(北京)有限公司；2*EasyTaqSupperMix，購自北京全式金生物技術有限公司；PCR引物合成及測序由北京三博遠志生物技術有限責任公司完成。

1.3 細菌的分離、鑒定 (1)膿皮病病例：用無菌生理鹽水對病灶表面進行沖洗，用浸有無菌BHI肉湯的棉簽蘸取新的膿汁或沿感染灶與健康組織交界處蘸取滲出物，于酒精燈旁接種5%哥倫比亞血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h；根據(jù)菌落的形態(tài)、顏色、溶血情況等，挑取不同的單菌落轉接至新的哥倫比亞血平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h～36 h；(2)健康犬皮膚：將一次性無菌采樣拭子用無菌生理鹽水浸濕后，分別對每只犬的右眼眼周、背部正中、左側腹股溝處皮膚進行采樣，并置于7.5%高鹽肉湯培養(yǎng)基，37℃孵育24 h～36 h。在超凈臺中，將培養(yǎng)后的菌液接種于高鹽甘露醇瓊脂培養(yǎng)基，置37℃恒溫箱孵育24 h～48 h。挑取單菌落轉接至新的高鹽甘露醇瓊脂培養(yǎng)基，進一步純化；(3)挑取單一形態(tài)菌落：經(jīng)染色、鏡檢后，經(jīng)BHI肉湯增菌培養(yǎng)，采用水煮法[2]提取DNA，并采用16S rDNA法(通用引物27F、1492R)及生化鑒定法對細菌進行鑒定。

1.4 藥敏試驗 對分離得到的葡萄球菌采用紙片擴散法進行藥物敏感性試驗。結果判定依CL.SI(2015修訂版)進行。

2 結果

2.1 北京地區(qū)警犬膿皮病病原菌的分離鑒定結果 從18例膿皮病患犬患處分離到細菌34株。其中葡萄球菌18株(52.94%)，芽孢桿菌11株(32.35%)，結果見表1。

表1 北京地區(qū)膿皮病警犬病原菌鑒定結果

2.2 北京地區(qū)警犬健康皮膚葡萄球菌分離鑒定結果 150個采集樣本中，共分離出葡萄球菌23株。其中，偽中間型葡萄球菌最多，6株，占26.1%，結果見表2。

表2 北京地區(qū)警犬健康皮膚葡萄球菌分離鑒定結果

2.3 膿皮病患病品種統(tǒng)計及健康犬皮膚葡萄球菌與樣本間關系 18例警犬膿皮病中，史賓格犬、德國牧羊犬病例數(shù)最高，各6例，分占33.33%，拉布拉多犬、馬里努阿犬、羅威納犬分別為3例、2例和1例。而健康犬皮膚分離的23株葡萄球菌，從品種看，7株(30.43%)來自于史賓格犬，占比最高；德國牧羊犬與羅威納犬均為5 株(21.74%)；馬里努阿犬及拉布拉多犬分別為4 株(17.39%)、2 株(8.7%)；從分離部位看，左腹股溝處分離出菌數(shù)量最多，為12 株(52.17%)，背部最少4株(17.39%)。

2.4 北京地區(qū)警犬皮膚葡萄球菌耐藥情況 對膿皮病警犬患處分離的18 株葡萄球菌及健康警犬皮膚分離的23 株葡萄球菌進行藥物敏感性試驗，全部葡萄球菌均對頭孢西丁敏感，結果見表3。多重耐藥(同時對3 種及3 種以上藥物耐藥)的菌株情況見表4。

表3 北京地區(qū)警犬皮膚分離葡萄球菌的耐藥情況

a：依照CLSI獸醫(yī)標準；b：金黃色葡萄球菌及路登葡萄菌依表格標準，其他葡萄球菌依S≥25、R≤24標準

表4 北京地區(qū)警犬分離葡萄球菌多重耐藥情況

3 討論

3.1 犬皮膚感染致病菌較多，且多為復合感染。在既往的研究中，犬膿皮病分離得到的病原菌并不完全一致，但葡萄球菌，尤其是偽中間型葡萄球菌為犬膿皮病的主要病原菌已成為動物醫(yī)學界的共識[3-10]，本試驗的結果再次證實了這一結論。但試驗中，從膿皮病患犬處未分離到鏈球菌、綠膿桿菌、微球菌、變形桿菌、棒狀桿菌等[4-7，9]致病菌，而薛占永等[8]在研究北京地區(qū)犬膿皮病的病原菌時同樣未分離到鏈球菌與綠膿桿菌，其原因可能與地域及季節(jié)等因素有關。另外，從健康犬皮膚表面分離得到的凝固酶陰性葡萄球菌相對較多，而某些凝固酶陰性葡萄球菌也具有特定致病性，可以引發(fā)動物及人感染[11-12]，仍不能忽視。

3.2 從患病犬統(tǒng)計看，史賓格犬、德國牧羊犬為膿皮病發(fā)病率最高的品種。從健康警犬皮膚分離的葡萄球菌在犬品種間的分布來看，史賓格犬體表分離到的葡萄球菌最多，與史賓格犬膿皮病發(fā)病病例較高相呼應。德國牧羊犬為人們已知的膿皮病易感品種，提示史賓格犬可能也具有膿皮病易感特性，應引起警犬技術人員的重視。

3.3 葡萄球菌為公認的犬膿皮病主要致病菌，故對其進行分離及藥物敏感性試驗。從試驗結果看，所有分離菌株均對頭孢西丁敏感，未篩查出耐甲氧西林葡萄球菌；對阿莫西林-克拉維酸、阿米卡星、氟苯尼考也全部敏感，為以后臨床提供更多選擇；對青霉素G耐藥率最高；而常用的皮膚病用藥-克林霉素在健康犬皮膚分離葡萄球菌的耐藥率僅為 8.70%，但對發(fā)病犬分離菌的耐藥率提高為 38.89%，提示其可能較易產生耐藥性，在用藥時要審慎選擇。而與近年相關研究結果相比較，分離菌藥物敏感性試驗結果及多重耐藥情況均優(yōu)于國內薛占永、楊靜等[8-9]的試驗，與國外研究的耐藥情況較為一致[5-7]。但從健康警犬皮膚分離的葡萄球菌耐藥情況看，雖然菌株對藥物敏感性情況優(yōu)于膿皮病患犬組，但對所用試驗藥物全部敏感的菌株僅占26.09%，仍有較多菌株對不同藥物耐藥，且存在著4株多重耐藥菌株，提示警犬皮膚葡萄球菌耐藥性存在的普遍性。

4 小結

由試驗可知，北京警犬膿皮病病原菌仍以葡萄球菌(偽中間型葡萄球菌)為主，皮膚分離葡萄球菌藥物敏感性情況要好于國內平均水平，但仍存在一定的耐藥性問題。警犬技術工作人員要加強對警犬皮膚細菌耐藥性的監(jiān)測，重點圍繞易感的史賓格犬和德國牧羊犬品種展開膿皮病的預防及治療工作，合理使用藥物，提高膿皮病治療效果的同時，減少細菌耐藥性的產生，更要加強防范，減免動物源性耐藥菌向人的傳播。

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2015-11-16

周傳鐸(1982-)，男，獸醫(yī)師，工程師，博士，從事警犬疾病防治工作，E-mail：zthxc@163.com

林德貴，E-mail：csamam@sina.com

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0529-6005(2016)11-0091-03