陳儉清 ， 周永輝 ， 楊艷北 ， 白靖文 ， 李艷華

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 黑龍江哈爾濱150030)

中藥水提物對體外豬鏈球菌生物被膜作用的試驗

陳儉清 ， 周永輝 ， 楊艷北 ， 白靖文 ， 李艷華

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 黑龍江哈爾濱150030)

豬鏈球菌耐藥性與生物被膜的形成有關(guān)，本試驗選取常用的20味清熱解毒的中藥，采用微量稀釋法測定20味中藥水提物的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)，采用卡爾加里生物被膜裝置和平板稀釋法測定20味中藥在亞MIC(1/2MIC)藥物濃度下對生物被膜的干預(yù)作用，結(jié)果表明：丁香葉、金銀花、黃芩、穿心蓮、黃柏和魚腥草等中藥水提物干預(yù)生物被膜效果顯著(P<0.05)大黃、黃連水提物干預(yù)生物被膜效果極顯著(P<0.01)，通過細菌計數(shù)發(fā)現(xiàn)，0～72h，1/2MIC中藥提取物對豬鏈球菌數(shù)量影，響不顯著(P>0.05)。丁香葉、大黃和黃連水提物對生物被膜中的豬鏈球菌具有很好的殺滅作用(P<0.05)。

中藥；生物被膜；豬鏈球菌；體外

豬鏈球菌是一種世界范圍的人獸共患病病原菌。能引起豬只的敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎和心內(nèi)膜炎。生物被膜是細菌產(chǎn)生的多聚復(fù)合物基質(zhì)，并將自身包繞，粘附于無活性物體或活體表面。生物被膜菌的耐藥性遠遠高于浮游態(tài)細菌。故在獸醫(yī)臨床急需安全有效并且廉價、不易產(chǎn)生耐藥性的治療方案。本試驗通過中藥水提物體外對生物被膜作用的研究，為篩選中藥和開發(fā)中藥提供新思路[1-2]。

1 材料與方法

1.1 中藥提取物的制備連翹、丁香葉、金銀花、柴胡、大黃、黃連、穿心蓮、魚腥草、黃柏、紫菀、大青葉、板藍根、訶子、荊芥、千里光、野菊花，購自中國藥材集團黑龍江省藥材公司。經(jīng)鑒別為道地藥材。稱取中藥各200 g 于燒杯中，粉碎(過2號篩不過3 號篩)，加蒸餾水2 L，室溫浸泡過夜。大火煮開后再用文火煎煮45 min，倒出藥液，過濾，再加入蒸餾水1.5 L 煎煮30 min，過濾。將兩次藥液混合，加熱濃縮為100 mL，濾液經(jīng)凍干機凍干。準(zhǔn)確稱量中草藥凍干粉末各1.0005 g，用4mL ddH2O溶解，離心取上清液，用0.22 μm濾膜過濾，保存在4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 菌株 野生型豬鏈球菌由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所饋贈，經(jīng)鑒定為豬鏈球菌。

1.3 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)

試驗操作及結(jié)果判定參照臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)推薦的標(biāo)準(zhǔn)微量稀釋法[4]。

1.4 豬鏈球菌生物被膜模型建立 將豬鏈球菌菌株接種于THB 瓊脂平板，3 7℃培養(yǎng)過夜。取單個菌落接種于THB 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h～16 h。將濁度為0.5 麥?zhǔn)蠁挝坏木合♂尀榧s1.0×105CFU/mL，取200 μL 接種于卡爾加里生物被膜裝置中，設(shè)置空白對照組，混勻后蓋好，37 ℃，50 r/min搖床上孵育72 h。取出卡爾加里生物被膜裝置(MBEC BiofilmTechnologies，Calgary，Alberta)，用移液器棄去培養(yǎng)基，并用滅菌的PBS(pH 值7.2)輕輕洗滌3 次以去除游離菌。將仍然附著在卡爾加里生物被膜裝置上的被膜菌用200μL 甲醇固定30 min。棄去固定液待自然風(fēng)干后，室溫下用200 μL 0.1%結(jié)晶紫對生物被膜染色30min。染色完畢，棄去染色液，用PBS(pH 值7.2)清洗兩次以去除游離的染色液，風(fēng)干，然后每孔加入200 μL 濃度為33%的冰乙酸溶液，置于振蕩器10 min 以釋放生物被膜中的結(jié)晶紫。酶標(biāo)儀595 nm處測定OD 值。

1.5 中藥水提物(濃度1/2MIC)對豬鏈球菌生物被膜的干預(yù)作用 將濁度為0.5 麥?zhǔn)蠁挝坏木合♂尩?.0×105CFU/mL，向卡爾加里生物被膜裝置每孔中和中藥提取物共200 μL(濃度1/2MIC)，另設(shè)空白對照孔，陰性對照孔和陽性對照孔，每個樣品5 個重復(fù)。37 ℃，50 r/min 搖床上孵育72 h，PBS 清洗2 次，固定，染色，測定OD595值。

1.6 中藥提取物(濃度1/2MIC)對豬鏈球菌生長的影響 通過2.5 的篩選，將具有干預(yù)作用的中藥水提物，配制成濃度為1/2MIC，菌液濃度為1.0×105CFU/mL，置于37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)，分別于0、6、12、24、36、72 h進行細菌計數(shù)，重復(fù)3次。

1.7 中藥提取物(濃度1/2MIC)對生物被膜下豬鏈球菌的殺滅作用 將濁度為0.5 麥?zhǔn)蠁挝坏木合♂尀榧s1.0×106CFU/mL，向卡爾加里生物被膜裝置每孔中加菌液和各藥液共200 μL(藥物濃度 1/2 MIC)，另設(shè)空白對照孔(只含培養(yǎng)基)和陰性對照孔(未加藥的生物被膜生長對照)，每個樣品5個重復(fù)，37 ℃，50 r/min 搖床上孵育72 h，從卡爾加里生物被膜裝置上取下形成生物被膜的樁釘，并使用滅菌PBS(pH值7.2)輕輕洗滌3次以去除游離菌，加入1 mL THB 培養(yǎng)基，置于超聲脫氣儀超聲振蕩，使生物被膜上的細菌剝脫至培養(yǎng)基內(nèi)。取10 μL 菌液，用THB 液體培養(yǎng)基做10 倍稀釋，從10倍稀釋至10 000倍。在THB固體平板上37 ℃培養(yǎng)24 h 后計數(shù)，每次測定均重復(fù)測3 次計算平均值，結(jié)果以log(CFU/mL)表示，觀察藥物對生物被膜內(nèi)菌量影響[4]。

1.8 掃描電鏡觀察生物被膜的形態(tài) 首先從卡爾加里生物被膜裝置上取下樁釘，并使用滅菌水PBS(pH 值7.2)輕輕洗滌3 次，除去游離菌，用pH值7.2 戊二醛固定，并置于4 ℃中固定1 h，1 次用pH 值7.2 PBS 沖洗兩次，每次均為0.17 h，再用50%、70%、90%進行脫水各1 次，每次0.17 h，然后用100%乙醇與叔丁醇1∶1，和叔丁醇各脫水1 次后，每次0.25 h，用低溫干燥儀對樣品進行干燥4 h，樣品表面在真空條件下鍍一層厚度為100A 的金屬膜，在SEM 下觀察。

2 結(jié)果

2.1 中藥水提物、阿奇霉素對豬鏈球菌最小抑菌濃度 通過肉湯微量稀釋法分別測定了各中藥水煎液對豬鏈球菌分離株的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)，結(jié)果見表1。

表1 20種中藥對豬鏈球菌的MIC和MBC (單位：mg/mL)

2.2 中藥提取物(濃度1/2MIC)對豬鏈球菌生物被膜的干預(yù)作用 見圖1，柱形圖由左向右依次為：連翹、丁香葉、金銀花、柴胡、大黃、鴨跖草、仙鶴草、千里光、野菊花、黃連、黃芩、板藍根、大青葉、穿心蓮、黃柏、紫菀、貫眾、魚腥草、荊芥、訶子、陽性對照組(阿奇霉素)和陰性對照組。與陽性對照組相比，丁香葉組、金銀花組、黃芩組、穿心蓮組、黃柏組與魚腥草組對豬鏈球菌生物被摸的形成有抑制作用(P<0.05)。大黃組、黃連組對豬鏈球菌生物被摸的形成有明顯的抑制作用，與陽性對照組比較差異極顯著(P<0.01)。

圖1 20種中藥對豬鏈球菌生物被膜干預(yù)的作用(n=5，X±SD)

2.3 中藥提取物(濃度1/2MIC)對豬鏈球菌生長的影響 見圖2中藥提取物(濃度1/2MIC)時，丁香葉、金銀花、黃芩、大黃、黃連、穿心蓮、黃柏與魚腥草對豬鏈球菌生長的影響，同時設(shè)置陽性對照組(阿奇霉素)和陰性對照組。與陰性照組比較，中藥水提物對細菌數(shù)量影響差異不顯著(P>0.05)。

圖2 中藥提取物(濃度1/2MIC)對豬鏈菌生長的影響

2.4 中藥提取物(濃度1/2MIC)對生物被膜下豬鏈球菌的殺滅作用 (見圖3)柱形圖由左向右依次為：連翹、丁香葉、金銀花、柴胡、大黃、黃連、穿心蓮、魚腥草、黃柏、紫菀、大青葉、板藍根、訶子、荊芥、千里光、野菊花、陽性對照組(阿奇霉素)和陰性對照組。丁香葉對生物被膜下的細菌具有顯著的殺滅作用(P<0.05)，大黃、黃連對生物被膜下的細菌具有極顯著的殺滅作用(P<0.01)。

圖3 中藥提取物(濃度1/2MIC)對生物被膜下豬鏈球菌的殺滅作用

2.5 掃描電鏡觀察生物被膜的形態(tài) 由圖4可見，通過掃描電鏡觀察陰性對照組、丁香葉、大黃、黃連和陽性對照組生物被膜的形成情況，(A)陰性對照組形成厚厚的黏液樣生物被膜，大量細菌鑲嵌被膜中。(B)、(C)和(D)為丁香葉、大黃和黃連水提物對生物被膜的抑制作用，形成黏液樣生物被膜量極少，細菌裸露在物體表面。(E)是陽性對照組，阿奇霉素具有很好的對細菌的殺滅作用，細菌數(shù)量非常少，沒有形成生物被膜。

圖4 掃描電鏡觀察生物被膜的形態(tài)學(xué)

A：陰性對照組； B、C、D、E：分別為丁香葉、大黃、黃連和陽性對照組

3 討論

目前國內(nèi)外研究結(jié)果表明，十四、十五元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類藥物具有干預(yù)或者消除S.suis生物被膜的作用[5]，但不是畜禽專用藥物。菌體也能減少豬鏈球菌生物被膜的形成，破壞生物被膜的結(jié)構(gòu)，但是其與抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用效果最好[6]，這些均限制了它們在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用。由于中草藥中含有大量結(jié)構(gòu)不同的化學(xué)成分，是新藥研究的寶貴資源，目前已發(fā)現(xiàn)松紅梅、蒲公英、甘草、牛膝具有抑制偽中間葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、變異鏈球菌生物被膜形成的作用，所以從中藥中篩選新的干預(yù)∕消除生物被膜藥物已成為當(dāng)前研究的熱點。

連翹、丁香葉、柴胡、金銀花、大黃、板藍根、大青葉、黃連、魚腥草、黃芩、黃柏、紫菀等20味中藥屬于辛涼解表或者清熱解毒類中藥，在臨床中常用且抑菌效果較好的一類抗菌中藥。如蓮花清瘟膠囊有抗金黃色葡萄球菌生物被膜形成的作用、金銀花有抑制大腸埃希菌生物被膜的活性、魚腥草水提液與阿奇霉素連用對銅綠假單胞菌抗生物被膜效果較好、中藥單體連翹苷和黃芩苷對表皮葡萄球菌生物被膜有抑制作用，還未見他們對豬鏈球菌生物被膜的抑制作用，故本試驗通過微量稀釋法測得20味中草藥對豬鏈球菌的MIC和MBC，及結(jié)晶紫染色法測得對豬鏈球菌生物被膜的干預(yù)作用，結(jié)果顯示，黃連、黃柏、訶子抑菌殺菌效果最好；連翹、丁香葉、大黃，鴨跖草、黃芩、板藍根次之。大黃、黃連對生物被膜形成抑制作用明顯，丁香葉、金銀花、黃柏、黃芩、魚腥草、穿心蓮次之[7-10]。

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Screening of Chinese herbal extracts against Streptococcus suis biofilm formation

CHEN Jian-qing ， ZHOU Yong-hui ， YANG Yan-bei ， BAI Jing-wen ， LI Yan-hua

(College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030， China)

In order to investigate the hypothesis that Chinese herbal eradicate the biofilm，we first determined the activity of twenty Chinese herbals which are often used for heat-clearing and detoxifying in traditional chinese prescription against planktonic cultures ofStreptococcussuisby the microdilution technique.The twenty Traditional Chinese medicines(TCMs)inhibited the growth ofStreptococcussuis(S.suis)planktoic cells at minimum inhibitory concentration(MIC).The assay was performed at sub-MIC levels and showed that Flos caryophylli，F(xiàn)los Lonicerae，Scutellaria，Andrographitis，cordate houttuynia and golden cypress extracts inhibit the biofilm formation(P<0.05).Chinese rhubarb and Coptis chinensis extracts significantly inhibited the biofilm formation(P<0.01).The effect of TCMs on the bacteria was not significant(P>0.05)by count in 0～72 h.Flos caryophylli，Chinese rhubarb and Coptis chinensis showed a strong bactericidal activity against the biofilm-forming cells compared with the negative control.The findings suggest that Flos caryophylli，Chinese rhubarb and Coptis chinensis not only inhibit the biofilm formation but also disinfect bacterial cells under biofilm.

Traditional Chinese medicines ； biofilm ；Streptococcussuis

LI Yan-hua

2015-12-24

國家科技支撐計劃子課題(2015BAD11B03-07)

陳儉清(1982-)，男，實驗師，碩士，主要從事獸醫(yī)藥理與毒理學(xué)研究，E-mail：chen-jianqing@hotmail.com

李艷華，E-mail：liyanhua1970@163.com

S852.65

A

0529-6005(2016)11-0014-03