陳艷芳，王若倫，劉培慶

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510260；2.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

RIP140重組腺病毒的構(gòu)建及在乳鼠心肌細胞中的表達

陳艷芳1，王若倫1，劉培慶2

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510260；2.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

目的 原代乳鼠心肌細胞為終末期的分化細胞，常規(guī)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低下。受體相互作用蛋白140(receptor-interacting protein 140，RIP140)目的基因長達3.5kb，為研究RIP140蛋白在非增殖型的心肌細胞表達情況，需要尋找一種更好的過表達系統(tǒng)。方法 RIP140基因全長序列克隆入pAdTrack-CMV穿梭載體中，在BJ5183細菌中與腺病毒骨架載體pAdEasy-1進行同源重組。經(jīng)酶切及測序驗證的陽性重組克隆轉(zhuǎn)染入AD293細胞中進行病毒的包裝與擴增。采用TCID50法測定病毒滴度、CCK-8試劑盒分析腺病毒對心肌細胞活力的影響。采用Western blot鑒定RIP140蛋白在心肌細胞中的表達情況。結(jié)果 測序分析結(jié)果表明RIP140的全長序列正確克隆到AdEasyTM腺病毒系統(tǒng)中。Ad-RIP140、Ad-GFP 的病毒滴度分別為1011.3和1011.7PFU·mL-1。腺病毒感染復(fù)數(shù)在200以下時，對心肌細胞活力無影響。綠色熒光及Western blot分析顯示Ad-RIP140感染心肌細胞12 h，RIP140表達明顯增加(P<0.05)。結(jié)論 成功構(gòu)建了RIP140全長序列的腺病毒載體，并使其蛋白有效表達于心肌細胞中，這將有助于后續(xù)進行RIP140在心肌細胞中的作用的研究。

腺病毒；同源重組；感染復(fù)數(shù)；細胞病理效應(yīng)；半數(shù)組織感染劑量；心肌細胞

受體相互作用蛋白140(receptor-interacting protein 140，RIP140)是一種重要的轉(zhuǎn)錄輔助因子，在調(diào)節(jié)組織能量代謝中扮演重要角色。研究報道[1]，RIP140通過抑制脂肪組織甘油三酯的分解與合成，影響脂肪細胞的分化。RIP140也能抑制骨骼肌的葡萄糖和脂肪酸代謝[2]。外源性過表達RIP140基因促進心肌肥大、纖維化的發(fā)生[3]，但其作用的機制仍不明確。因此，建立RIP140目的基因的過表達系統(tǒng)，研究其在各組織、細胞中的調(diào)節(jié)機制尤為重要。心臟的工作與能量代謝密切聯(lián)系，而心肌細胞是高度分化的非增殖原代細胞，常用的質(zhì)粒過表達體系轉(zhuǎn)染心肌細胞存在轉(zhuǎn)染率低、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染細胞毒性大的弊端，而RIP140基因序列又長達3.5 kb，故亟需尋找一種能滿足高包裝容量、高轉(zhuǎn)染效率以及低細胞毒性的過表達載體系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 腺病毒穿梭載體pAdTracker-CMV與骨架載體pAd Easy-1由中山大學(xué)生命科學(xué)院實驗室提供，DNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、LA Taq、BglⅡ、EcoRⅤ、T4 DNA Ligase酶、pMD18-T vector(日本TaKaRa公司)；PmeⅠ、PacⅠ酶 (美國NEB公司)；IPTG、X-gal、卡那霉素、氨芐霉素、Ecoli DH5α感受態(tài)、Top 10感受態(tài)(天根公司)；膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小提試劑盒、質(zhì)粒DNA中提取純化試劑盒(美國Omega公司)；發(fā)光液、核蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司)；CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；蛋白電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、GEL DOC 2000成像系統(tǒng)、蛋白定量酶標儀(美國BioRad公司)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)

1.2 RIP140基因擴增與鑒定 RIP140基因的編碼區(qū)由單一外顯子構(gòu)成，截取一小段大鼠鼠尾，提取基因組DNA并擴增目的基因模板。根據(jù)大鼠RIP140的基因序列設(shè)計引物序列，參考穿梭質(zhì)粒pAd Tracker-CMV圖譜上的酶切位點，在上游引物加入BglⅡ酶切位點和2個保護堿基，下游引物加入EcoRⅤ酶切位點和3個保護堿基。最終引物序列如下：上游：GAAGATCTATGACTCATGGAGAAGAG CTTG；下游：CCGGATATCTCACTCGCACTCTTTTTTTA。PCR擴增RIP140基因的條件為：94℃ 5 min, (94℃ 30s, 58.3℃ 30 s, 72℃ 4min)×32 cycles, 72℃ 10 min。1.3 重組穿梭載體pTracker-RIP140的構(gòu)建與鑒定

1.3.1 pT-RIP140載體的構(gòu)建 膠回收目的DNA片段，與T克隆載體連接過夜，轉(zhuǎn)化Top 10感受態(tài)后鋪在含氨芐霉素抗性的瓊脂糖平板表面進行藍白斑篩選。選取10個白色克隆，搖菌、提取質(zhì)粒DNA用EcoRⅤ、BglⅡ進行雙酶切鑒定。能切出3.5 kb處條帶對應(yīng)的克隆送去華大基因廣州公司測序，堿基序列與GenBank中公布的大鼠源性RIP140基因一致的克隆命名為pT-RIP140。

1.3.2 RIP140克隆于穿梭載體pAdTracker-CMV 切膠回收RIP140基因片段，與EcoRⅤ、BglⅡ雙酶切后的pAdTracker-CMV質(zhì)粒DNA連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ecoli DH5α感受態(tài)細菌，再均勻涂布于含卡那霉素抗性的瓊脂糖培養(yǎng)基平板進行篩選，挑取單克隆搖菌擴增、提取質(zhì)粒DNA，再用EcoRⅤ和BglⅡ雙酶切方法進行鑒定，將能切出3.5 kb左右的片段的陽性克隆命名為pTracker-RIP140。

1.4 重組腺病毒基因pAd-RIP140的構(gòu)建與鑒定 將含腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的BJ5183菌株涂布在氨芐抗性的平板上進行篩選，挑取單克隆菌落搖菌并擴增，加入預(yù)冷的0.1mol·L-1CaCl2-MgCl2溶液(80 mmol·L-1MgCl2，20 mmol·L-1CaCl2)制備含腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的BJ5183感受態(tài)細菌。重組的穿梭載體pTracker-RIP140用PmeⅠ酶切線性化，轉(zhuǎn)化上述制備好的BJ5183感受態(tài)細菌，與腺病毒骨架質(zhì)粒在BJ5183中進行同源重組。挑取5個單克隆菌落搖菌、擴增，提取質(zhì)粒DNA后經(jīng)Pac I線性化酶切鑒定，能切出4.5或3kb左右位置的條帶的為重組陽性克隆，命名為pAd-RIP140。

1.5 重組腺病毒包裝、擴增與純化 重組的陽性克隆重新轉(zhuǎn)化到Ecoli DH5a中進行穩(wěn)定擴增，搖菌、大量抽提質(zhì)粒DNA，經(jīng)PacⅠ酶切、酚/氯仿抽提、乙醇沉淀后在無菌條件下溶于滅菌雙蒸水中。將Pac I線性化的pAd-RIP140用lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染AD293細胞，直至在熒光顯微鏡下觀察到明顯的細胞病變(cytopathic effect, CPE)。收集病毒上清液，以5%～10%的比率重新感染AD293細胞，重復(fù)以上擴增過程，直至病毒增殖到第4代的時候基本穩(wěn)定時，收集上清、CsCl密度梯度離心法進行純化、分裝，于-80℃保存。純化后的腺病毒命名Ad-RIP140，對照組為空白穿梭載體與腺病毒載體的同源重組，重組后的包裝、擴增與純化方案均與Ad-RIP140相同，空白對照病毒命名為Ad-GFP。

1.6 重組腺病毒的滴度測定 采用半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量法(50% tissue culture infectious dose, TCID50)測定腺病毒滴度。準備細胞密度為108個·L-1的AD293細胞，96孔板中加入倍比稀釋的病毒，以10-4～10-12稀釋濃度感染細胞，96孔板每行留2孔作為陰性對照。于37℃培養(yǎng)10 d后熒光顯微鏡下觀察，計算每一橫排中出現(xiàn)CPE的孔數(shù)。當陰性對照中不出現(xiàn)CPE且細胞生長良好，最低稀釋度100% CPE陽性而最高稀釋度100% CPE陰性，則認為本測試即為有效。腺病毒滴度用KARBER統(tǒng)計法精確算出：對于100 μL的稀釋液，滴度為T=101+d(s-0.5)

d=lg10 of dilution,s=the sum of ratios (包括最初的10-1稀釋度);

T=a×10bTCID50/mL=a×10b-0.7PFU/mL; MOI=PFU/cell numbers。

1.7 腺病毒介導(dǎo)的目的基因在乳鼠心肌細胞的鑒定 原代乳鼠心肌細胞的培養(yǎng)參考文獻[4]，心肌細胞培養(yǎng)36 h后，分別加入重組腺病毒Ad-RIP140及對照Ad-GFP，直接覆蓋心肌細胞表面，37℃孵箱中培養(yǎng)4h后補加適當體積的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)感染20 h，熒光顯微鏡下觀察GFP情況，確定感染效率。病毒36 h后，抽提總蛋白，采用Western blot驗證RIP140在心肌細胞過表達情況。以不同MOI的病毒滴度感染心肌細胞，加入20 μL的Counting Cell Kit-8(CCK-8)，測定490nm處吸光度，觀察腺病毒對心肌細胞活力的影響。

2 結(jié)果

2.1 pT-RIP140載體的構(gòu)建 PCR擴增的產(chǎn)物為單一條帶，大小位于3 500 bp左右(Fig 1A)。重組質(zhì)粒用Bgl Ⅱ和 EcoR Ⅴ雙酶切鑒定，分別切出3 500 bp位置條帶及2 900 bp位置的條帶，分別與RIP140基因和pMD18-T vector質(zhì)粒載體大小位置一致(Fig 1B)。將酶切驗證后的克隆進一步測序分析，序列比對后顯示與Genebank發(fā)表的RIP140基因序列一致，將陽性克隆命名為pT-RIP140。

2.2 重組穿梭載體pTrack-RIP140的構(gòu)建 膠回收T載體上的RIP140基因條帶，與用Bgl Ⅱ和EcoR Ⅴ雙酶切后的穿梭載體pAdTracker-CMV(9.2 Kbp左右)DNA連接過夜，轉(zhuǎn)化后挑取12個單克隆搖菌，提取質(zhì)粒DNA再用Bgl Ⅱ和EcoR Ⅴ雙酶鑒定。如Fig 2所示，6號克隆能切出3500bp左右的小條帶與9000bp左右的大條帶，分別與預(yù)期的RIP140基因和pAdTracker-CMV基因大小一致，將6號重組陽性質(zhì)粒命名為pTracker-RIP140。

2.3 重組腺病毒載體pAd-RIP140的構(gòu)建與鑒定Pme I線性化處理重組穿梭質(zhì)粒pTracker-RIP140 (Fig 3A)，在BJ5183感受態(tài)細胞中與病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1進行同源重組。重組的腺病毒質(zhì)粒通過卡那霉素初步篩選，最后再用Pac I進行酶切鑒定分析。挑取24個最小單克隆擴增，提取質(zhì)粒DNA并進行瓊脂糖電泳，初步估計大小在10kb以上單克隆為重組腺病毒陽性克隆。如Fig 3B所示，4號克隆為陰性克隆，其余克隆初步估計為陽性克隆，需進一步PacⅠ酶切驗證。PacⅠ酶切重組腺病毒通常會得到約30kb的片段和一個3.0或4.5 kb的小片段，小片段的大小取決于重組位置。如Fig 3C所示，挑取的重組目的基因克隆與陰性對照克隆經(jīng)PacⅠ酶切，均得到位于4.5 kb處的條帶(Fig 3C)，說明重組RIP140腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功，且同源重組發(fā)生在復(fù)制起始位置與右臂之間。構(gòu)建好的RIP140腺病毒重組質(zhì)粒命名為pAd-RIP140，不含目的基因的同源重組為陰性對照，命名為pAd-GFP。

Fig 1 Cloning RIP140 gene into a pMD18-T vector.

M: 10kb Maker. (A), 1-2: RIP140 production by PCR. (B), 1-2: Recombinant plasmid digested by restriction enzymes Bgl II and EcoR V.

Fig 2 The Cloning screen and characterization of recombinant plasmid pTrack-RIP140.

M1: Maker, 2 000bp; M2: Maker, 10 000 bp. 1～12: Screening positive pTracker-RIP140 clone.

2.4 重組腺病毒的包裝、擴增及滴度測定 得到的重組腺病毒用Pac I線性化，轉(zhuǎn)染AD293細胞后產(chǎn)生重組病毒顆粒。轉(zhuǎn)染2 d后，GFP綠色熒光逐漸增多，15 d的時候局部細胞變圓、脫落，細胞拉伸成網(wǎng)狀并出現(xiàn)熒光聚集現(xiàn)象(Fig 4A箭頭所示)，呈現(xiàn)典型的細胞病變效應(yīng)(CPE)。擴增到第4代時候，細胞在感染病毒36h后明顯變圓并脫落(Fig 4B)，CPE現(xiàn)象明顯，病毒增殖基本穩(wěn)定，留少量作滴度測定，其余分裝并凍存-80℃。采用TCID50測定腺病毒滴度，據(jù)測定并計算，Ad-RIP140和Ad-GFP的滴度T分別為1011.3和1011.7PFU·mL-1。2.5 不同感染滴度腺病毒對心肌細胞感染效率及細胞活力的測定 如Fig 5A所示，Ad-RIP140的MOI增加到100時，心肌細胞的病毒感染率達90% 以上。相同MOI值情況下Ad-GFP對照組感染率比Ad-RIP140組略高。細胞活力測定結(jié)果顯示(Fig 5B)，Ad-RIP140的MOI值在200以下時，腺病毒本身對心肌細胞的活力并無影響，增高到400時，心肌細胞活力明顯下降。結(jié)合感染效率和細胞毒性測定所得到的結(jié)果，我們認為Ad-RIP140感染心肌細胞合適的MOI為100。

Fig 3 Construction and screening of recombinant plasmid pAd-RIP140.

(A), M: Maker; 1: p-Tracker-RIP140 digested by linear enzyme Pme I; 2: pAdTrack-CMV digested by linear enzyme Pme I. (B), M:Maker; 1-9: Clone 1～9; 10: pAdTrack-CMV control; 11: pAdEasy-1 control. (C), M1: 23 kb λ-Hing Ⅲ digest Maker; M2: 10kb Maker; 1～2: Positive clone digested by Pac I enzyme; 3～4: pAd-GFP control digested by Pac I enzyme.

Fig 4 Production of viral plaques and amplification of recombinant adenovirus.

A: Tipical CPE in cardiomyocytes after RIP140 virus infection from 2 to 15days; B: The fourth generation of Ad-RIP140 infected cardiomyocytes for 18 and 36h.

2.6 Western blot檢測RIP140蛋白在乳鼠心肌細胞中的表達變化 重組腺病毒轉(zhuǎn)染細胞后能否合成外源性蛋白，是腺病毒載體構(gòu)建成功與否的關(guān)鍵標志。通過熒光顯微鏡我們觀察到病毒隨感染滴度升高和感染時間的延長，心肌細胞內(nèi)GFP熒光的強度逐漸增加(Fig 6A)。給予一定MOI(100)的Ad-RIP140感染心肌細胞，通過Western bolt分析我們觀察到心肌細胞外源性RIP140蛋白在感染36h時達最高峰(P<0.05)，之后不再隨感染時間的延長而變化(Fig 6B，P>0.05)。故Ad-RIP140腺病毒病毒感染乳鼠心肌細胞的最佳感染時間為36 h。

3 討論

心肌細胞是一高度分化的非增殖原代細胞，常用的質(zhì)粒過表達體系轉(zhuǎn)染心肌細胞最大的問題在于轉(zhuǎn)染率極低，且對于脂質(zhì)體介導(dǎo)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，隨脂質(zhì)體和基因載體用量加大，細胞毒性也明顯增大。RIP140基因長達3.5 kb，與普通的質(zhì)粒載體DNA連接起來有較大困難。重組腺病毒載體作為外源性DNA轉(zhuǎn)入真核細胞的工具，具有高滴度、高感染率、宿主范圍廣、插入容量大等優(yōu)點，是用作非增殖細胞過表達工具的最佳選擇。

本研究參考He等[5]在1998年建立的腺病毒載體構(gòu)建的方法，并按Luo等[6]方案加以改進。研究所用的AdEasyTM系統(tǒng)由穿梭質(zhì)粒pAdTracker-CMV與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1構(gòu)成。本研究中重組 腺病毒構(gòu)建方案改進主要體現(xiàn)在以下幾方面：首先，RIP140目的基因序列過長，若將其直接與穿梭質(zhì)粒連接，由于后者也接近10 kb，要成功連接并不容易，再者即使連接成功后測序驗證也存在難度。所以我們首先將其插入T-載體進行藍白斑篩選、經(jīng)測序驗證正確后再與穿梭質(zhì)粒連接，這一改進并不增加實驗的繁瑣，反而提高了實驗的成功率、節(jié)約了實驗時間，此調(diào)整方案可供后續(xù)研究者參考。相比較其他重組腺病毒的構(gòu)建，穿梭載體pAdTracker-CMV融合了巨細胞病毒啟動子CMV啟動子，并含有表達綠色熒光蛋白的GFP基團，可通過GFP的熒光強度與蛋白表達情況了解腺病毒的產(chǎn)生，省去了煩瑣的空斑純化過程，還能夠直接觀察感染效率。重組腺病毒基因組DNA的E1區(qū)被外源目的基因取代后，進入靶細胞后病毒雖不能復(fù)制，但可以表達目的蛋白，外源性蛋白在靶細胞中的表達豐度可通過改變病毒的滴度而變得可控，可為RIP140的后續(xù)研究提供可靠的量效分析。E3區(qū)的缺失不僅使得插入的外源基因容量擴大，還可以大大降低腺病毒對宿主細胞的免疫原性。早期研究中，腺病毒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)染293A細胞大多采用磷酸鈣共轉(zhuǎn)化沉淀法，本研究中利用脂質(zhì)體作為轉(zhuǎn)染介質(zhì)，亦得到滿意結(jié)果，說明該方法可有效地用于腺病毒DNA的轉(zhuǎn)染，可供后續(xù)研究者借鑒。

Fig 5 Infection effeciency and cell vitality detection for Ad-RIP140 and Ad-GFP control. Adenovirus infection effeciency (A) and cell vitality detection (B) for Ad-RIP140 and Ad-GFP control at 0 to 400 MOI.

Fig 6 Best time of Ad-RIP140 in cardiomyocytes by fluorescence and Western bolt analysis.

A:Fluorescence analysis; B: RIP140 protein level by Western bolt analysis in cardiomyocytes after infected Ad-RIP140 at 12 h, 24 h, 36 h, 48h and 60 h.*P<0.05vs0 h.

本研究中，利用這種新的腺病毒載體系統(tǒng)，在AD293細胞中成功包裝出重組腺病毒Ad-RIP140，參考王爽等[7]選擇SFDA和FDA推薦的TCID50方法，基于最高稀釋度下AD293細胞中病變效應(yīng)(CPE)的形成，測定病毒滴度，Ad-RIP140腺病毒最終滴度高達1011PFU·mL-1。質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細胞細胞毒性大，外源基因過表達率通常不足20%，而借助腺病毒載體系統(tǒng)，觀察到MOI為100時，Ad-RIP140感染乳鼠心肌細胞就高達90%以上，Western blot也進一步驗證了目的基因在心肌細胞的高效表達，且MOI在200以下對細胞活力均無影響。總之，Ad-RIP140感染乳鼠心肌細胞符合了高滴度、高感染率、高容量插入、低細胞毒性等優(yōu)點。通過成功制備表達RIP140基因的重組腺病毒載體，并使其在原代乳鼠心肌細胞中獲得高效、穩(wěn)定、安全的表達，有利于進一步研究RIP140在心肌能量代謝中的調(diào)控作用。

(致謝：本研究內(nèi)容的腺病毒穿梭載體pAdTracker-CMV與骨架載體pAdEasy-1由中山大學(xué)生命科學(xué)院實驗室提供，在中山大學(xué)藥學(xué)院藥理毒理實驗室完成。)

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Construction of RIP140 recombinant adenovirus and its expression in neonatal rat cardiomyocytes

CHEN Yan-fang1，WANG Ruo-lun1，LIU Pei-qing2

(1.DeptofPharmacy,theSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510260,China;2.SchoolofPharmaceuticalSciences，SunYat-senUniversity，Guangzhou510006,China)

Aim The limited transfection efficiency for plasmid in primary neonatal rat cardiomyocytes, which are terminal differentiated cells, and long foreign DNA (the RIP140 gene sequence are as long as 3.5 kb) cause us to choose a better system to study RIP140 gene expression in primary non-replicative cells. Methods Full-length of RIP140 was cloned into pAdTracker-CMV shuttle vector, and then recombined with virus backbone pAdEasy-1 vector in BJ5183 bacteria. Positive recombinant plasmid was confirmed by sequence analysis and restriction enzyme determination, and then transfected into AD293 cells for amplification. Titers of virus particles were determined by Tissue Culture Infectious Dose 50 (TCID50) method and cell vitality was analyzed by CCK-8 kit in cardiomyocytes. RIP140 gene was identified by Western blot. Results Sequence analysis suggested that full-length RIP140 gene was cloned correctly into AdEasyTM system. Virus titers of Ad-RIP140 and Ad-GFP were 1011.3and 1011.7PFU·mL-1, respectively. Cell vitality was not affected when the Multiplicity of Infection (MOI) was lower than 200. Green fluorescent protein (GFP) and Western blot analysis showed RIP140 gene was remarkably increased in cardiomyocytes for 12h infection by Ad-RIP140(P<0.05). Conclusion Recombinant adenovirus containing RIP140 gene was successfully constructed and effectively expressed in cardiomyocytes. These will be helpful for further research on the function of RIP140 in cardiomyocytes.

adenovirus; homologous recombination; multiplicity of infection; cytopathic effect; tissue culture infectious dose 50; cardiomyocytes

時間：2016-12-5 15:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.038.html

2016-06-27，

2016-09-12

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81402923)

陳艷芳(1984-)，女，博士，副主任藥師，研究方向：心血管藥理學(xué)，Tel: 020-34152377，E-mail: yfchen312@126.com； 劉培慶(1964-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，通訊作者，Tel: 020-39943026，E-mail: peiqingliu2013@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.019

A

1001-1978(2016)12-1735-06

R-332；R322.11；R341；R373.1；R394.2；R977.6