李會哲，周曉紅，張 穎，靳曉飛，高維娟

(1.承德醫(yī)學院病理生理學教研室，河北 承德 067000；2.河北中醫(yī)學院，河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治重點實驗室，河北 石家莊 050200)

◇研究簡報◇

黃芪甲苷對缺氧缺糖/復氧復糖PC12細胞TLR4通路的影響

李會哲1，周曉紅2，張 穎2，靳曉飛1，高維娟2

(1.承德醫(yī)學院病理生理學教研室，河北 承德 067000；2.河北中醫(yī)學院，河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治重點實驗室，河北 石家莊 050200)

缺氧缺糖/復氧復糖；黃芪甲苷；PC12細胞；TLR4蛋白；MyD88蛋白；細胞凋亡

TLR4受體已經(jīng)被證明在腦缺血中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[1]。 黃芪甲苷可明顯減輕大鼠腦缺血/再灌注損傷中的腦梗死面積，抑制神經(jīng)細胞凋亡[2]。黃芪甲苷是否通過TLR4/MyD88通路來抑制細胞凋亡？本文以PC12細胞為實驗對象，研究黃芪甲苷對缺氧缺糖/復氧復糖PC12細胞TLR4通路的影響，探討黃芪甲苷抑制細胞凋亡的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物和細胞 黃芪甲苷購自上海士峰生物科技有限公司，純度≥98%(生產(chǎn)批號：15010913) ，PC12細胞由河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院科研中心許順江教授惠贈。

1.1.2 試劑和儀器 抑制劑Cli095購自Invivogen公司，TLR4多克隆一抗購自Biovision公司，MyD88單克隆一抗購自CST公司，二抗IgG購自博士德生物有限公司，Caspase-3多克隆一抗和NF-κB 多克隆一抗均購自巴傲得生物科技有限公司，普通培養(yǎng)箱3111型和三氣培養(yǎng)箱3131型購自賽默爾菲公司。

2 方法

2.1 PC12細胞的造模及實驗分組 參照Kikuchi等[3]的方法建立缺氧缺糖/復氧復糖細胞模型： 移除原培養(yǎng)基換用無糖Earle′s液，隨即把培養(yǎng)瓶放入 三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，換正常培養(yǎng)基放入普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取對數(shù)期PC12細胞，隨機分為7組：正常對照組、正常+黃芪甲苷組、缺氧缺糖/復氧復糖組(模型組)、DMSO組、黃芪甲苷組(AST，100 μmol·L-1)、Cli095組(3 μmol·L-1)、黃芪甲苷+Cli095組。第1組正常培養(yǎng)，不進行任何處理。 后4組均于造模前0.5 h給藥，直至培養(yǎng)結(jié)束。第2組在正常培養(yǎng)液加入100μmol·L-1的黃芪甲苷，給藥方式同后4組。免疫組化檢測caspase-3和NF-κB ，Western blot方法檢測MyD88和TLR4蛋白表達。

3 結(jié)果

caspase-3 結(jié)果：與正常組相比，正常+黃芪甲苷組沒有統(tǒng)計學差異，而模型組陽性細胞數(shù)明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，DMSO組陽性細胞數(shù)沒有明顯差異(P>0.05)，但黃芪甲苷組、抑制劑組、黃芪甲苷+Cli095組陽性細胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與黃芪甲苷組比較，黃芪甲苷+抑制劑組陽性細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而Cli095組增加(P<0.05)，見Tab 1。NF-κB 各組變化趨勢與caspase-3 相同，見Tab 2 。 MyD88和TLR4的結(jié)果趨勢同caspase-3結(jié)果相同，見Tab 3，4。

GroupDose/μmol·L-1CellquantityNormal-1.00±0.002Normal+AST1001.25±0.50Model-86.50±1.29#DMSO0.00182.00±3.16#AST10026.00±5.10*Cli095350.75±4.65△AST+Cli095100+325.00±6.16*

#P<0.05vsnormal;*P<0.05vsmodel;△P<0.05vsAST

GroupDose/μmol·L-1CellquantityNormal-1.03±0.03Normal+AST1001.25±0.002Model-85.55±1.33#DMSO0.00183.08±2.13#AST10025.98±4.32*Cli095352.15±4.36△AST+Cli095100+324.85±5.16*

#P<0.05vsnormal;*P<0.05vsmodel;△P<0.05vsAST

GroupDose/μmol·L-1GrayvalueNormal-124.33±30.57Normal+AST100118.00±29.61Model-384.33±26.31#DMSO0.001375.00±22.00#AST100177.00±54.14*Cli0953291.33±14.98△AST+Cli095100+3184.67±55.52*

#P<0.05vsnormal；*P<0.05vsmodel；△P<0.05vsAST

GroupDose/μmol·L-1GrayvalueNormal-77.67±39.31Normal+AST10071.00±36.06Model-434.33±69.60#DMSO0.001427.67±70.40#AST100102.67±5.03*Cli0953305.33±86.58△AST+Cli095100+3136.67±32.65*

#P<0.05vsnormal;*P<0.05vsmodel;△P<0.05vsAST

4 討論

當機體腦缺血/再灌注損傷時，TLR4受體被激活，與細胞內(nèi)MyD88相結(jié)合的同時使信號由細胞外傳遞到細胞內(nèi)[4]，并且激活一系列下游反應，最終導致I-κb磷酸化而降解與MAPK家族的激活[5]。前者使NF-κB移位到細胞核內(nèi)，NF-κB 能使TNF-α等炎性細胞因子轉(zhuǎn)錄并在細胞中高度表達，大量的炎癥瀑布最終導致細胞凋亡[6]。后者激活的MAPK家族使JNK等在細胞中高度表達[7]，部分激活的JNK在胞質(zhì)中促進細胞色素釋放，激活caspase-3等引起細胞凋亡[8]，綜上所述，TLR4/MyD88通路機制可以導致細胞發(fā)生凋亡。

(致謝：本實驗在河北中醫(yī)學院科研中心，在高維娟老師的指導下，周曉紅、張穎老師、靳曉飛師弟的幫助下完成。)

[1] Susanna V, Jing-Huan W, Mika R. The Drosophila Toll signaling pathway[J].JImmunol, 2011, 186(2):649-56.

[2] Xiao H, Zhang J J, et al. The mechanism of astragaloside Ⅳ promoting sciatic nerve regeneration[J].NeuralRegenRes, 2013, 8(24):2256-65.

[3] Kikuchi K,Kawahara K,Biswas K K, et al. Minocycline attenuates both OGD-induced HMGB1 release and HMGB1-induced cell death in ischemic neuronal injury in PC12 cells[J].BiochemBiophysResCommun, 2009, 385(2): 132-6.

[4] Drouin-Ouellet J, Gibrat C, Bousquet M, et al. The role of the MYD88-dependent pathway in MPTP-induced brain dopaminergic degeneration[J].JNeuroinflammation, 2011, 8(44):1-12.

[5] Wang C, Deng L, Hong M, et al. TAK1 is a ubiquitin-dependent kinase of MKK and IKK[J].Nature, 2001, 412(6844):346-51.

[6] Qing W Y, Feng L L, Yu Z, et al. HMBG1 mediates ischemia-reperfusion injury by TRIF-adaptor independent Toll-like receptor 4 signaling[J].JCerebrBloodFlowMetab, 2011, 31(2):593-605.

[7] Taro K, Shizuo A. Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors[J].TrendsMolMed, 2007, 13(11):460-9.

[8] 幸享鳳，王恬竹，秦新月. CRMP2可通過改善神經(jīng)細胞凋亡減輕缺血/再灌注大鼠神經(jīng)功能缺損[J]. 中國藥理學通報，2016，32(4)：548-53.

[8] Xing X F,Wang T Z,Qin X Y. CRMP2 alleviates neurological deficit by reducing neuron apoptosis in rats after cerebral ischemia/reperfusion injury[J].ChinPharmacolBull，2016，32(4)：548-53.

Effect of astragaloside on TLR4 pathway in cultured PC12 cells with oxygen glucose-deprivation and reperfusion

LI Hui-zhe1,ZHOU Xiao-hong2,ZHANG Ying2,JIN Xiao-fei1,GAO Wei-juan2

(1.DeptofPhysiopathology,ChengdeMedicalCollege,Chengde,Hebei067000,China; 2.HebeiUniversityofChineseMedicine,HebeiKeyLaboratoryofChineseMedicineResearchonCardio-cerebrovascularDiseases,Shijiazhuang050200,China)

時間：2016-12-5 15:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.052.html

2016-06-14,

2016-08-30

河北省應用基礎(chǔ)研究計劃重點項目(No 16967756D); 河北省科技支撐計劃項目(No 13272504D); 河北省普通高校高層次人才科學研究計劃項目(No GCC2014031)

李會哲(1987-)，女，碩士,研究方向：缺血性腦血管病的發(fā)病機制及中醫(yī)藥防治,E-mail:524987216@qq.com; 高維娟(1966-)，女，博士，教授，博士生導師,研究方向：缺血性腦血管病的發(fā)病機制及中醫(yī)藥防治,通訊作者,E-mail:gwj6088@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.026

A

1001-1978(2016)12-1772-02

R284.1；R329.25；R392.11；R743.310.22；R977.6