曾于樺，邵 英，李 洋，陳前昭，任文艷，周林云，周 益，劉榮興，何百成

(1. 重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，2. 重慶醫(yī)科大學藥理教研室，重慶 400016)

白藜蘆醇抑制人結腸癌細胞增殖的作用與促進骨形態(tài)蛋白9及其受體表達的關系研究

曾于樺1，2，邵 英1，2，李 洋1，2，陳前昭1，2，任文艷1，2，周林云1，2，周 益1，2，劉榮興1，2，何百成1，2

(1. 重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，2. 重慶醫(yī)科大學藥理教研室，重慶 400016)

目的 研究白藜蘆醇(resveratrol, Res)對人結腸癌LoVo細胞增殖的抑制作用與骨形態(tài)蛋白9(bone morphorgenetic protein 9, BMP9)之間的可能關系。方法 采用結晶紫染色與流式細胞術檢測Res對LoVo細胞增殖的抑制作用；流式細胞術檢測Res對LoVo細胞凋亡的誘導作用。利用RT-PCR和Western blot檢測Res在LoVo細胞中對BMP9表達的影響，以及對BMP9的受體ALK2和ALK3表達的影響。采用ALK2和ALK3的抑制劑，通過結晶紫染色分析BMP9介導Res抑制LoVo細胞增殖的可能機制。結果 與對照組相比，Res明顯呈濃度依賴性抑制LoVo細胞增殖，并誘導LoVo細胞發(fā)生S期阻滯; Res呈濃度依賴性增加LoVo細胞凋亡比例；Res促進BMP9的mRNA表達并明顯增加其蛋白水平；外源性過表達BMP9能增強Res對LoVo細胞的增殖抑制和誘導凋亡作用；Res能誘導BMP9的受體ALK2和ALK3的mRNA表達，抑制ALK2和ALK3能明顯促進LoVo細胞增殖，并減弱Res對LoVo細胞增殖的抑制作用。結論 Res對LoVo細胞的增殖具有明顯抑制作用，這種作用可能與Res促進BMP9及其受體表達有關。

白藜蘆醇；骨形態(tài)蛋白9；結腸癌；LoVo細胞；增殖抑制

結腸癌是臨床常見的一種消化系統(tǒng)惡性腫瘤，每年約有近100萬新增結腸癌患者，大約60萬的患者死于結腸癌[1]。結腸癌的發(fā)生與多種因素有關，其中調節(jié)細胞增殖與分化的關鍵信號通路調節(jié)失控被認為是結腸癌的發(fā)生的主要原因之一，如TGF-β信號和Wnt/β-catenin信號等[2-3]。其中，TGF-β信號不僅參與調節(jié)胚胎的發(fā)育和個體內環(huán)境平衡，同時也參與調節(jié)細胞的增殖與分化。研究顯示，TGF-β受體或Smad突變均能明顯增加結腸癌的發(fā)生危險。近年來，隨著對結腸癌發(fā)病機制認識的進一步深入和開展早期篩查，其臨床治療已有較大改善，5年生存率也有明顯提高[1]。這種提高也與近年來一些靶向藥物的成功應用有關，如貝伐單抗和西妥昔單抗等，但結腸癌的治療效果及預后狀況仍不十分理想[4]。因此，臨床急需開發(fā)新型或高效的結腸癌治療藥物?；熕幬锏亩拘耘c癌細胞轉移是結腸癌治療所面臨的最主要挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)中藥是抗癌藥物的重要來源之一，如長春新堿等早已用于結腸癌的治療[5]。白藜蘆醇(resveratrol, Res)又名芪三酚，主要來源于虎杖、葡萄、花生、桑葚等植物[6]。作為一種多酚類物質，Res具有明顯的抗氧作用，故可用于防治高血脂、動脈粥樣硬化、冠心病以及缺血性心臟病等疾病[7-8]。除此之外，研究表明Res還具有明顯的抗腫瘤作用，能有效地抑制多種腫瘤細胞增殖并促進細胞凋亡，如乳腺癌、結腸癌、肺癌和肝癌等[9-10]。到目前為止，Res抗腫瘤作用的機制仍不十分清楚。本研究將進一步分析Res抑制結腸癌細胞增殖的作用及可能的分子機制，為將Res開發(fā)成用于治療和預防結腸癌的藥物或輔助藥物提供相應的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑及細胞培養(yǎng) LoVo細胞購自American Type Culture Collection(ATCC)。白藜蘆醇(resveratrol, Res)購自西安昊軒生物科技有限公司，所用一抗均購自Santa Cruz Biotechnology公司，ALK2和ALK3抑制劑(LDN-193189)購自賽力克公司(selleck)。LoVo細胞置于37 ℃，5%的CO2孵箱中，采用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、青霉素100 U·ml-1和鏈霉素0.1 g·L-1)進行培養(yǎng)。

1.2 實驗設計及分組 按實驗要求，設置對照組和實驗組。采用DMSO溶解Res，實驗組的細胞采用不同濃度的Res進行處理，對照組細胞則用相同體積的DMSO進行處理。

1.3 結晶紫染色實驗 將生長良好的LoVo細胞消化后種到24孔板中，等細胞貼壁后用不同濃度的Res(0、10、20、40、60和80 μmol·L-1)或同體積的DMSO進行處理。24 h、48 h或72 h后進行結晶紫染色，檢測Res對LoVo細胞增殖能力的影響。具體方法簡述如下：棄培養(yǎng)基后用PBS小心清洗24孔板2次，每孔加5%的結晶紫染液(用PBS緩沖的10%甲醛配制)0.5 mL，于室溫下孵育20 min。棄結晶紫染液，然后用自來水將24孔板小心清洗干凈并置于空氣中自然風干，最后進行掃描或定量分析。每組實驗重復3次。

1.4 流式細胞術周期和凋亡分析實驗 將生長狀態(tài)良好的LoVo細胞均勻種于6孔板，等細胞貼壁以后采用不同濃度的Res(0、20、40和60 μmol·L-1)或同體積的DMSO進行處理。48 h后收集細胞并按試劑盒說明書操作，然后通過流式細胞儀進行周期分析；對細胞進行凋亡分析時，利用不含EDTA的胰酶消化并收集細胞，按試劑盒說明進行實驗，最后通過流式細胞儀進行凋亡分析。每組實驗重復3次。1.5 RNA提取及RT-PCR實驗 將生長狀態(tài)良好的LoVo細胞消化并種到T25培養(yǎng)瓶，等細胞貼壁后加入不同濃度的Res(0、20、40和60 μmol·L-1)或同體積DMSO進行處理。利用TRIzol法提取總RNA,然后通過逆轉錄反應制備cDNA，最后通過PCR檢測目的基因mRNA表達水平變化情況。所用引物如下：GAPDH 上游引物5′-CAACGAATTTGGCTACAGCA -3′, 下游引物5′-AGGGGAGATTCAGTGTG GTG-3′；BMP9上游引物5′-CCTGGGCACAACAAGGAC-3′,下游引物5′-CCTTCCCTGGCAGTTGAG-3′；ALK2上游引物5′-AGGGCTCATCACCACCAA-3′,下游引物5′-TTCCGTTTCCCTGAACCA-3′；ALK3上游引物5′-TCAGATGGTCCGGCAAGT-3′,下游引物5′-CATGGCGCATTAGCACAG-3′。每組實驗重復3次。

1.6 Western blot實驗 將生長狀態(tài)良好的LoVo細胞消化后均勻種于6孔板，用不同濃度Res(0、20、40和60 μmol·L-1)或同體積DMSO對細胞進行處理。于相應時間點提取各處理組的總蛋白，按常規(guī)方法進行Western blot實驗，最后利用ECL試劑盒顯影并采集圖像。每組實驗重復3次。

2 結果

2.1 Res對LoVo細胞增殖的影響 Res對多種腫瘤細胞具有增殖抑制作用，但具體機制仍不十分清楚。為進一步分析Res抑制結腸癌細胞增殖的機制，本研究首先分析Res對LoVo細胞的增殖影響。結晶紫染色分析結果顯示，Res對LoVo細胞的增殖抑制作用呈濃度和時間依賴性增強(Fig 1A)。周期分析結果顯示，Res能明顯誘導LoVo細胞發(fā)生S期阻滯(Fig 1B)。以上實驗結果表明，Res對LoVo細胞的增殖具有明顯抑制作用。

Fig 1 Effects of Res on proliferation in LoVo cells

A:Crystal violet staining results showed the effect of Res on proliferation in LoVo cells; B：Flow cytometery analysis results showed the effect of Res on cell cycle arrest in LoVo cells

2.2 Res對LoVo細胞凋亡的影響 抗腫瘤藥物多數(shù)都能誘導細胞凋亡，因此本研究進一步分析Res對LoVo細胞凋亡的影響。流式分析結果顯示，經(jīng)Res處理后，LoVo細胞凋亡比例明顯隨藥物濃度升高而增加，當Res為20 μmol·L-1時LoVo就已明顯出現(xiàn)凋亡(Fig 2)。結果提示, Res對LoVo細胞的凋亡具有促進作用。

2.3 Res對LoVo細胞中BMP9表達的影響 以上實驗結果再次證明Res對結腸癌細胞的增殖具有明顯抑制作用，但具體機制仍不清楚。骨形態(tài)蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)屬于TGF-β超家簇成員，對細胞的增殖分化具有重要調節(jié)作用，同時BMPs信號的異常也與結腸癌的發(fā)生及發(fā)展密切

Fig 2 Effects of Res on apoptosis in LoVo cells

Flow cytometry analysis results showed the effect of Res on apoptosis in LoVo cells.

相關。文獻報道，BMP9能抑制胃癌細胞的遷移、侵襲和增殖，但目前尚不清楚BMP9是否對結腸癌細胞也有類似的作用。為此本研究首先分析Res在結腸癌細胞中對BMP9表達的影響。RT-PCR檢測結果顯示，Res能明顯促進BMP9的mRNA表達(Fig 3A)。Western blot分析結果顯示，經(jīng)Res處理后LoVo細胞中BMP9蛋白水平也明顯升高(Fig 3B)。進一步分析表明，在FHC和幾種常見的結腸癌細胞中，BMP9均存在內源性表達；并且BMP9在FHC細胞中的水平明顯高于結腸癌細胞(Fig 3C)。結果提示 BMP9可能與Res抑制LoVo細胞增殖和誘導凋亡有關。

2.4 BMP9對Res抑制LoVo細胞增殖和誘導凋亡作用的影響 Res能促進BMP9表達，而BMP9本身對細胞的增殖與分化具有重要調節(jié)作用，因此本研究進一步分析BMP9對Res抑制LoVo細胞增殖作用的影響。結果顯示，外源性過表達BMP9能明顯抑制LoVo細胞增殖(Fig 4A)，增強Res對LoVo細胞的S期阻滯作用(Fig 4B)，以及增強Res誘導Bad表達和抑制Bcl-2表達的作用(Fig 4C)；沉默BMP9雖然不能逆轉Res對Bcl-2表達的抑制作用，但能明顯減弱Res對Bad表達的誘導作用(Fig 4C)。結果提示，上調BMP9可能參與介導Res對LoVo細胞的增殖抑制和誘導凋亡作用。

2.5 ALK2/3對Res抑制LoVo細胞增殖作用的影響 BMP9與其受體ALK2和ALK3結合，通過經(jīng)典或非經(jīng)典BMPs/Smads信號通路發(fā)揮各種作用。RT-PCR分析結果顯示，Res能明顯促進BMP9的受體，即ALK2和ALK3的表達(Fig 5A)。Western blot實驗結果顯示，經(jīng)Res處理后雖然BMP9表達明顯升高，但并未明顯增加Smad1/5/8的磷酸化水平，而是有一定程度降低。提示，BMP9在LoVo細胞中的作用可能與非經(jīng)典BMPs/Smads信號有關(Fig 5B)。進一步分析表明，抑制ALK2/3能促進LoVo細胞增殖，并減弱Res對LoVo細胞的增殖抑制作用(Fig 5C)。以上結果提示，BMP9可能通過非經(jīng)典BMPs/Smads信號介導Res對LoVo細胞的增殖抑制作用。

3 討論

結腸癌作為一種臨床常見的惡性消化系統(tǒng)腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率，僅次于肝癌、肺癌和胃癌，每年全球約有近60萬的患者因結腸癌而死 亡[1]。目前治療結腸癌所面臨的主要挑戰(zhàn)包括傳統(tǒng)化療藥物的嚴重不良反應以及癌細胞的轉移等。雖然對結腸癌的診斷和治療水平都已有較大程度的提高，但其預后仍不十分樂觀。因此，臨床急需一些高效而低毒性的抗腫瘤藥物。本研究結果顯示，Res對人結腸癌LoVo細胞具有明顯的增殖抑制和促進凋亡作用；Res的這種作用可能與其促進BMP9及其受體表達有關，但Res促進BMP9表達的詳細機制尚不清楚。

Fig 3 Effects of Res on expression of BMP9 in LoVo cells

A： RT-PCR assay results showed the effect of Res on mRNA expression of BMP9 in LoVo cells； B： Western blot analysis results showed the effect of Res on the level of BMP9 in LoVo cells； C： Western blot analysis results showed the endogenous expression of BMP9 in FHC cell and colon cancer cells.

Fig 4 Effects of BMP9 on anti-proliferation and apoptosis inducing effects of Res in LoVo cells

A： Crystal violet staining results showed the effect of BMP9 on the proliferation of LoVo cells； B： Flow cytometry assay results showed the effect of BMP9 on Res induced cell cycle arrest in LoVo cells； C： Western blot analysis results showed the effect of exogenous BMP9 on Res-induced apoptosis in LoVo cells； D： Western blot analysis results showed the effect of knockdown BMP9 on Res-induced apoptosis in LoVo cells.

結腸癌的發(fā)生與多種因素有關，包括生活方式、年齡和基因突變等。文獻報道， TGF-β和Wnt/β-catenin等多種信號轉導在結腸癌細胞中明顯存在異常[2-3]。TGF-β信號在胚胎發(fā)育、個體穩(wěn)態(tài)的維持以及調節(jié)細胞增殖分化等過程中扮演著重要的角色。BMPs作為TGF-β超家族的成員，與其受體結合后通過經(jīng)典或非經(jīng)典BMPs/Smads信號，調節(jié)細胞的增殖、分化與凋亡等過程。BMPs信號參與調節(jié)多種腫瘤細胞的生物學特性，BMP6能抑制乳腺癌細胞增殖，但促進前列腺癌骨轉移并對雄激素耐藥[11-12]；卵巢癌癌旁間充質干細胞表達部分BMPs成員，其中BMP4和BMP6對腫瘤細胞生長具有促進作用，而BMP2則抑制癌細胞生長[13]。不同BMPs成員對癌細胞增殖的影響不一致，可能與細胞種類以及細胞突變類型及微環(huán)境有關。研究表明，在結腸癌細胞中正常的BMPs信號能抑制癌細胞生長，該信號異常與結腸癌發(fā)生有關；Samd4缺失明顯促進結腸癌細胞轉移[14]，BMP4能誘導結腸癌細胞分化并增加其對化療藥物的敏感性[15]。BMP9是目前已發(fā)現(xiàn)的誘導干細胞成骨分化最強的因子之一，同時對多種腫瘤細胞的增殖也具有明顯影響，如抑制乳腺癌細胞增殖和促進骨肉瘤細胞增殖[16-17]。到目前為止，BMP9對結腸癌細胞的影響還不清楚。

Res是一種天然的多酚類物質，主要來源于葡萄、虎杖、花生、桑葚等植物。因具有明顯的抗氧化作用，所以Res可用于相關心血管疾病的防治，如動脈粥樣硬化等。近來越來越多的研究表明，Res具有明顯的抗腫瘤作用，能抑制多種腫瘤細胞的增殖并促進其凋亡，如肺癌、肝癌、乳腺癌和結腸癌細胞等[9-10]。Res的抗腫瘤作用機制可能與增強p53功能、抑制Wnt/β-catenin和促進PTEN表達等有關[18-19]，但具體作用機制仍不清楚。

Fig 5 Effects of ALK2/3 inhibitor on the anti-proliferation effect of Res in LoVo cells

A:RT-PCR assay results show the effect of Res on the expression of ALK2 and ALK3 in LoVo cells; B: Western blot analysis results show the effect of Res on the phosphorylation of Smad1/5/8 in LoVo cells. (B) Crystal violet staining results show the effect of ALK2/3 inhibitor on the anti-proliferation effect of Res in LoVo cells(LDN: inhibitor for ALK2 and ALK3).

課題組前期研究已證實Res對結腸癌細胞的增殖具有抑制作用，機制可能與促進PTEN表達有關[20 ]；由于BMP9在促進干細胞成骨分化的過程中，能明顯抑制PTEN表達，所以課題組推測Res抑制結腸癌細胞增殖可能與抑制BMP9表達有關。結果顯示，Res不僅不抑制BMP9表達，而且明顯促進BMP9表達；BMP9在正常結腸上皮細胞FHC中的表達水平明顯高于在結腸癌細胞中的表達水平(Fig 3)。提示BMP9可能對結腸上皮細胞的增殖具有重要調控作用并參與Res對結腸癌細胞的增殖抑制作用。進一步分析表明，外源性過表達BMP9能抑制LoVo細胞的增殖，并明顯增強Res對結腸癌細胞的增殖抑制作用(Fig 4A，B)；外源性過表達BMP9明顯增強Res誘導LoVo凋亡的作用，而沉默BMP9則能部分逆轉Res對LoVo細胞的這種作用(Fig 4C，D)。因此Res抑制LoVo細胞增殖可能與其促進BMP9表達有關。BMP9與其受體結合后可通過經(jīng)典與非經(jīng)典BMPs/Smads信號發(fā)揮作用。結果顯示,Res能促進BMP9的受體(ALK2和ALK3)表達，但并不能增加Smad1/5/8的磷酸化水平；同時，抑制ALK2和ALK3明顯減弱Res對LoVo細胞增殖的抑制作用(Fig 5)。提示，在LoVo細胞中，BMP9可能通過非經(jīng)典的BMPs/Smads信號發(fā)揮對細胞增殖的抑制作用。

本研究結果證實Res能明顯抑制結腸癌細胞的增殖，具有潛在治療和預防結腸癌的作用；Res可能通過促進BMP9表達并激活非經(jīng)典BMPs/Smads信號通路實現(xiàn)這種作用，但具體機制仍不清楚。課題組將進一步分析Res在結腸癌細胞中促進BMP9表達及抑制結腸癌細胞增殖的可能分子機制，研究結果將有利于促進Res的臨床應用開發(fā)。

[致謝:本研究主要在重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室完成。課題組感謝芝加哥大學何通川(Tongchuan He)教授為本研究提供所需的重組腺病毒載體(BMP9和GFP)]

[1] Tárraga López P J, Albero J S, Rodriguez-Montes J A. Primary and secondary prevention of colorectal cancer[J].ClinMedInsightsGastroenterol, 2014, 7:33-46.

[2] Bellam N, Pasche B. Tgf-beta signaling alterations and colon cancer[J].CancerTreatRes, 2010, 155: 85-103.

[3] Sebio A, Kahn M, Lenz H J. The potential of targeting Wnt/β-catenin in colon cancer[J].ExpertOpinTherTargets, 2014, 18(6):611-5.

[4] Tol J, Punt C J. Monoclonal antibodies in the treatment of metastatic colorectal cancer: a review[J].ClinTher, 2010, 32: 437-53.

[5] Sun Q L, Zhao C P, Wang T Y, et al. Expression profile analysis of long non-coding RNA associated with vincristine resistance in colon cancer cells by next-generation sequencing[J].Gene, 2015, 572(1):79-86.

[6] Wang K H, Lai Y H, Chang J C, et al. Germination of peanut kernels to enhance resveratrol biosynthesis and prepare sprouts as a functional vegetable[J].JAgricFoodChem, 2005, 53(2):242-6.

[7] Petrovski G, Gurusamy N, Das D K. Resveratrol in cardiovascular health and disease[J].AnnNYAcadSci, 2011, 1215:22-33.

[8] 孫 杰,孫文佳,陳北冬，等. 白藜蘆醇降低ox-LDL誘導血小板ROS產(chǎn)生和PECAM-1表達的分子機制研究[J]. 中國藥理學通報，2015,31(11):1608-14.

[8] Sun J,Sun W J,Chen B D,et al. Effect of resveratrol on ROS production and PECAM-1 expression in ox-LDL-stimulated platelets[J].ChinPharmacolBull，2015,31(11):1608-14.

[9] Singh C K, Ndiaye M A, Ahmad N. Resveratrol and cancer: Challenges for clinical translation[J].BiochimBiophysActa, 2015,1852(6):1178-85.

[10] 劉理靜,錢 紅,張 平，等. 白藜蘆醇對人胚肺成纖維細胞株MRC-5生長的抑制作用[J]. 中國藥理學通報， 2015,31(5):673-9.

[10] Liu L J,Qian H,Zhang P,et al. Inhibitory effects of resveratrol on human pulmonary fibroblast line MRC-5 growth[J].ChinPharmacolBull， 2015,31(5):673-9.

[11] Hu F, Meng X, Tong Q, et al. BMP-6 inhibits cell proliferation by targeting microRNA-192 in breast cancer[J].BiochimBiophysActa, 2013,1832(12):2379-90.

[12] Lee G T, Kang D I, Ha Y S, et al. Prostate cancer bone metastases acquire resistance to androgen deprivation via WNT5A-mediated BMP-6 induction[J].BrJCancer, 2014, 110(6):1634-44.

[13] Peng J, Yoshioka Y, Mandai M, et al. The BMP signaling pathway leads to enhanced proliferation in serous ovarian cancer-A potential therapeutic target[J].MolCarcinog, 2016, 55(4):335-45.

[14] Itatani Y, Kawada K, Fujishita T, et al. Loss of SMAD4 from colorectal cancer cells promotes CCL15 expression to recruit CCR1+ myeloid cells and facilitate liver metastasis[J].Gastroenterology, 2013 , 145(5):1064-75.

[15] Lombardo Y, Scopelliti A, Cammareri P, et al. Bone morphogenetic protein 4 induces differentiation of colorectal cancer stem cells and increases their response to chemotherapy in mice[J].Gastroenterology, 2011, 140(1):297-309.

[16] 黃 軍,劉映孜，袁霜雪，等. 環(huán)氧酶-2在骨形態(tài)蛋白9誘導間充質干細胞骨向分化中的作用研究[J]. 中國藥理學通報, 2014，30(7):1006-11.

[16] Huang J, Liu Y Z,Yuan S X,et al. Study on the role of COX-2 in BMP9 induced osteogenic differentiation in mesenchymal stem cells[J].ChinPharmacolBull, 2014，30(7):1006-11.

[17] Ren W, Liu Y, Wan S, et al. BMP9 inhibits proliferation and metastasis of HER2-positive SK-BR-3 breast cancer cells through ERK1/2 and PI3K/AKT pathways[J].PLoSOne, 2014, 9(5):e96816.

[18] Lin H Y, Tang H Y, Davis F B, et al. Resveratrol and apoptosis[J].AnnNYAcadSci, 2011, 1215:79-88.

[19] 袁霜雪，王東旭，伍秋香，等. 白藜蘆醇抑制HCT116結腸癌細胞增殖與Wnt/β-catenin的關系研究[J]. 中國藥理學通報，2015，31(4)：537-41.

[19] Yuan S X,Wang D X,Wu Q X,et al. Study on the relationship between the anti-proliferation effect of resveratrol on HCT116 colon cancer cells and Wnt/β-catenin[J].ChinPharmacolBull，2015，31(4)：537-41.

[20] 胡 培，伍秋香，袁霜雪，等. 白藜蘆醇抑制人結腸癌細胞增殖及其與PTEN的關系研究[J]. 第三軍醫(yī)大學學報, 2015, 37(10):1006-11.

[20] Hu P,Wu Q X,Yuan S X,et al.Study on the relationship between the anti-proliferation effect of resveratrol and PTEN in colon cancer cells[J].ChinPharmacolBull,2015,37(10):1006-11.

Study on relationship between anti-proliferation effect of resveratrol and resveratrol-induced bone morphogenetic protein 9 and its receptors in colon cancer cells

ZENG Yu-hua1,2,SHAO Ying1,2,LI Yang1,2,CHEN Qian-zhao1,2,REN Wen-yan1,2,ZHOU Lin-yun1,2,ZHOU Yi1,2,LIU Rong-xing1,2,HE Bai-cheng1,2

(1.DeptofPharmacology,SchoolofPharmacy,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;2.ChongqingKeyLaboratoryofBiochemistryandMolecularPharmacology,Chongqing400016,China)

Aim To study the anti-proliferation effect of resveratrol (Res) and the role of Res-induced bone morphorgenetic protein 9 (BMP9) in this process in colon cancer cells. Methods Crystal violet staining and flow cytomtry were introduced to assay the anti-proliferation effect of Res in LoVo cells. The effect of Res on apoptosis in LoVo cells was also detected with flow cytometry. Then, RT-PCR and Western blot assay were employed to unveil the effect of Res on the expression of BMP9. The effect of BMP9 on the anti-proliferation of Res in LoVo cells was analyzed with crystal violet staining and flow cytometry too. Finally, the effect of Res on the expression of ALK2 and ALK3 was assayed with RT-PCR, and the inhibitor of ALK2 and ALK3 was used to figure out the possible mechanism of BMP9 on Res-induced proliferation inhibition in LoVo cells. Results Res apparently inhibited the proliferation, arrested the cell cycle at S phase in LoVo and increased the percentage of apopotic cells in LoVo cells. Res increased the expression of mRNA and protein of BMP9 concentration dependently. Exogenous expressed-BMP9 enhanced the anti-proliferation and apoptosis inducing effects of Res in LoVo cells, but BMP9 knockdown decreased these effects of Res. Although Res had no apparent effect on increasing the phosphorylation of Smad1/5/8, it increased the expression of ALK2 and ALK3. Inhibition of ALK2 and ALK3 decreased the anti-proliferation effect of Res partly in LoVo cells. Conclusion Res is potent to inhibit the proliferation of LoVo cells, Which may be mediated by up-regulating the expression of BMP9 and its receptor at least.

resveratrol; BMP9; colon cancer; LoVo cells; anti-proliferation

時間：2016-12-5 15:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.028.html

2016-07-08，

2016-09-05

國家自然科學基金資助項目(No 81572226)

曾于樺(1991-)，女，碩士生，研究方向：分子藥理學，E-mail: 214981529@qq.com； 何百成(1972-)，男，博士，教授，研究方向：分子藥理學和干細胞生物學，通訊作者，E-mail: hebaicheng99@yahoo.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.014

A

1001-1978(2016)12-1705-07

R282.71；R329.24；R341；R392.11；R735.35；R979.1