陳 曦 趙怡蕊

（山西中醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030006）

芪術(shù)膠囊對(duì)糖尿病腎病大鼠的影響研究

陳 曦 趙怡蕊△

（山西中醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030006）

目的通過(guò)研究芪術(shù)膠囊干預(yù)后糖尿病腎病大鼠的體液和腎組織的改變，觀察其對(duì)核因子κB（NF-κB）表達(dá)的影響。方法 選取60只成年健康雄性大鼠，設(shè)正常組大鼠10只，50只大鼠剔除死亡1只和造模未成功大鼠19只，將造模成功后大鼠30只隨機(jī)分為3組：模型組、芪術(shù)膠囊組、科素亞組。自成模第9周起，正常組、模型組給予蒸餾水、芪術(shù)膠囊組給予芪術(shù)膠囊（1 g/kg），科素亞組給予科素亞 （1.67 mg/kg），每日1次，連續(xù)灌胃8周。檢測(cè)各組大鼠NF-κB表達(dá)水平及果糖胺，腎功能尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）、血清胱抑素（Cys-c），超敏C反應(yīng)蛋白（CRP），糖化血紅蛋白（HbA1c）。結(jié)果 芪術(shù)膠囊組可顯著降低DN大鼠的HbA1C、24 h尿蛋白、腎功能指標(biāo)和NF-κB水平，并且優(yōu)于科素亞組（P＜0.05或P＜0.01）；能有效延緩DN腎組織的纖維化進(jìn)展。結(jié)論 芪術(shù)膠囊對(duì)糖尿病腎病大鼠的NF-кB表達(dá)具有一定積極的影響。

糖尿病腎病 芪術(shù)膠囊 核因子κB糖尿病腎病（DN）導(dǎo)致終末期腎?。‥SRD）和糖尿病患者死亡的主要原因［1］。根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（IDF）統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)我國(guó)糖尿病患者大約1.7億［2］，給國(guó)家和社會(huì)帶來(lái)了諸多負(fù)擔(dān)，因此探討DN的發(fā)病機(jī)制，并尋求有效的防治措施具有重要意義。芪術(shù)膠囊是本課題組經(jīng)過(guò)多年研究篩選治療DN的經(jīng)驗(yàn)方，在臨床上取得了良好的療效。目前研究表明，核因子кB（NF-κB）在免疫、炎癥、缺血、硬化等相關(guān)疾病中發(fā)揮重要的作用［3］，該因子引領(lǐng)DN發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)入了一個(gè)嶄新的階段。正常狀態(tài)下，NF-κB存在于腎小球細(xì)胞的胞漿中，當(dāng)受到外來(lái)信號(hào)刺激時(shí)被活化，參與調(diào)控免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等，導(dǎo)致腎臟功能及組織學(xué)異常［4］。本研究旨在進(jìn)一步探討芪術(shù)膠囊對(duì)DN的NF-κB表達(dá)的影響，采用對(duì)照方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器 芪術(shù)膠囊：規(guī)格：0.5 g/粒，主要成分：黃芪、蒼術(shù)、地龍等，晉制劑批號(hào)：20100711?？扑貋啠汉贾菽硸|有限公司，規(guī)格：50 mg/片，批號(hào)110024。鏈脲佐菌素（STZ，批號(hào)：20101013，美國(guó)Sigma公司）。肌酐試劑盒、甘油三酯試劑盒、總膽固醇試劑盒：北京北化康泰臨床試劑有限公司提供；352型酶標(biāo)儀、AC8洗板機(jī)：芬蘭；微量高速離心機(jī)：YG16W；隔水式恒溫培養(yǎng)箱：GNP-9080；免疫組化試劑盒（APAAP法）；RIPA蛋白裂解液：碧云天公司；ELISA檢測(cè)試劑盒；鑷子、眼科剪、70%乙醇（三蒸水配制），1.5 mL離心管、液氮；研磨機(jī)、鑷子、冰盒、離心機(jī)、RIPA；高精度加樣器及槍頭：0.5～10、2～0、20～200、200～1000 μL；

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量120 g；許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0004，由山西省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供。

1.3 模型制備 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按50 mg/kg腹腔注射枸櫞酸鈉緩沖液（pH4.4）配制的STZ。72 h后鼠尾靜脈取血測(cè)定血糖，血糖＞16.7 mmol/L，為糖尿病模型成功。6周后測(cè)尿微量白蛋白（Alb）、血糖（FBG），高于正常值者為DN造模成功［5］。

1.4 分組與給藥 剔除1只死亡老鼠和19只未成模老鼠，將30只成模大鼠隨機(jī)分成3組：模型組、芪術(shù)膠囊組、科素亞組，每組各10只，另設(shè)正常對(duì)照組10只，共4組。自成模第9周起，正常組、模型組給予蒸餾水，芪術(shù)膠囊組給予芪術(shù)膠囊（1 g/kg），科素亞組給予科素亞（1.67 mg/kg），每日1次，連續(xù)灌胃8周。所有大鼠均自由飲水和進(jìn)食普通飼料。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）尿液：采用代謝籠法，各組分別于每4周末收集24 h尿液，保存于-80℃冰箱。進(jìn)行尿常規(guī)、24 h尿蛋白定量檢測(cè)。2）血液：造模后第8周，用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉各組大鼠，由腹主動(dòng)脈采血約6 mL，室溫下靜置2 h，3000 r/min離心10 min，取上游血漿-80℃保存，測(cè)定果糖胺，腎功能尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）、血清胱抑素（Cys-c），超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP），糖化血紅蛋白（HbA1c）。3）腎組織：大鼠取血后，取出腎臟組織置于液氮中，最后-80℃冰箱保存，進(jìn)行腎組織病理觀察及NF-κB水平檢測(cè)。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。對(duì)于計(jì)量資料，符合正態(tài)分布的，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符和正態(tài)分布的資料則采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果 見(jiàn)表1。與正常組比較，模型組大鼠HbA1c含量顯著升高（P＜0.01），芪術(shù)膠囊組較模型組有明顯降低（P＜0.05），科素亞組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明芪術(shù)膠囊可以顯著降低DN大鼠HbA1c水平。與正常組相比，模型組大鼠血清BUN、Scr、Cys-c和24 h尿蛋白明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，芪術(shù)膠囊、科素亞組差異均明顯（P＜0.05或P＜0.01），芪術(shù)膠囊組不僅具有降低大鼠血清BUN、Scr、Cys-c和24 h尿蛋白的作用，而且在改善HbA1c和Cys-C方面作用優(yōu)于科素亞組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠血清HbA1c、24 h尿蛋白、腎功能指標(biāo)和NF-κB水平比較（）

表1 各組大鼠血清HbA1c、24 h尿蛋白、腎功能指標(biāo)和NF-κB水平比較（）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與芪術(shù)膠囊組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與科素亞組比較，△P＜0.05。

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2.2 各組大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)觀察 見(jiàn)圖1。HE染色光鏡見(jiàn)：正常組腎小球結(jié)構(gòu)完整，間質(zhì)無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組腎小球基底膜彌漫性增厚，系膜輕中度增厚，毛細(xì)血管瘤樣改變，腎小球有明顯體積增大和細(xì)胞增多，腎小管上皮細(xì)胞有壞死脫落和水腫，小管腔中有透明管型，腎間質(zhì)存在炎性細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；芪術(shù)膠囊組與科素亞組也相似腎組織病理改變，但較模型組有一定程度減輕（P＜0.05）。表明芪術(shù)膠囊能延緩DN腎組織纖維化的進(jìn)展。

圖1 各組大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)觀察（HE染色，400倍）

2.3 各組大鼠NF-κB測(cè)定結(jié)果比較 與正常組相比，模型組大鼠NF-κB測(cè)定結(jié)果明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，芪術(shù)膠囊、科素亞組差異明顯（P＜0.05或P＜0.01），表明芪術(shù)膠囊在改善腎功能方面作用優(yōu)于科素亞組。

3 討 論

近年來(lái)國(guó)內(nèi)有關(guān)DN中醫(yī)及中西醫(yī)結(jié)合研究的文獻(xiàn)資料非常豐富［6］，由于中醫(yī)的辨證論治常受到醫(yī)者主觀性及經(jīng)驗(yàn)性的影響，故大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道中方藥繁復(fù)，缺少?gòu)姆肿由飳W(xué)的深入研究，因此缺乏療效較好又廣為公認(rèn)的有效治療藥物。

中醫(yī)理論認(rèn)為脾為后天之本，氣血生化之源?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為胰腺屬于中醫(yī)脾的范疇，“脾虛濕?！?，“郁久化熱”后天之本無(wú)以濡養(yǎng)先天之本“腎”，故DN基本病機(jī)為脾腎兩虛，濕熱瘀阻多見(jiàn)。芪術(shù)膠囊是按照健脾活血、清熱燥濕法［7］應(yīng)用于臨床十余年有效的基礎(chǔ)上，不斷精減篩選的藥物制劑，適用于早、中期糖尿病患者。方中黃芪配當(dāng)歸健脾養(yǎng)血活血，蒼術(shù)伍黃柏清熱燥濕，水蛭與地龍活血化瘀，大黃利濕清熱泄?jié)峄钛Ｈ脚湮楹侠?，為本?xiàng)目的選題提供了理法方藥的合理性依據(jù)。

芪術(shù)復(fù)方是經(jīng)過(guò)多年臨床篩選的經(jīng)驗(yàn)方，前期進(jìn)行了膠囊工藝的制備與研究，同時(shí)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)以及驗(yàn)室和研究人員帶隊(duì)，具有中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室等國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科研三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，我院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室先后開(kāi)展過(guò)多項(xiàng)細(xì)胞和動(dòng)物大量臨床研究證實(shí)芪術(shù)復(fù)方所代表的健脾活血清熱燥濕法具有降低尿蛋白，改善腎功能的作用，治療有效率達(dá)87.5%［8-9］。作用于DN大鼠可降低血糖，降低SCr、BUN，減少24h尿蛋白定量，明顯改善腎臟病理變化，具有良好的腎臟保護(hù)作用［10］。

有研究表明，NF-κB在腎臟炎癥的進(jìn)一步加劇等過(guò)程中起重要作用［11］，其參與DN發(fā)生發(fā)展機(jī)制雖然尚未明確，但與DN的發(fā)生、發(fā)展有著密切聯(lián)系。本研究說(shuō)明DN可造成大鼠機(jī)體正常生理功能、病理形態(tài)的紊亂，并從分子學(xué)角度初步分析了各組大鼠腎臟和血清，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，找到組間差異，觀察到芪術(shù)膠囊對(duì)糖尿病腎病的NF-κB的影響同時(shí)，分析了科素亞、芪術(shù)膠囊對(duì)DN大鼠的腎臟、血清NF-κB的調(diào)節(jié)趨勢(shì)和優(yōu)劣，為DN的的早期診斷、防治提供有力依據(jù)，為后續(xù)的研究提供了思路。而芪術(shù)膠囊、科素亞都能從一定程度上改善這種情況，且某些方面芪術(shù)膠囊組更具有優(yōu)勢(shì)。

綜上所述。本課題從分子學(xué)角度對(duì)芪術(shù)膠囊治療糖尿病腎病進(jìn)行療效評(píng)價(jià)［12-13］，為DN的防治提供新的思路與方法，有效延緩DN進(jìn)展，為芪術(shù)膠囊的研究開(kāi)發(fā)具有廣闊的市場(chǎng)前景［14-15］。

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R285.5

A

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（2016-05-31）