謝春英，徐雪松，楊照微，何成彥，黃麗紅，王 海，周勁松

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗(yàn)科，吉林 長(zhǎng)春130033)

APT5A1在大腸癌中的表達(dá)及意義

謝春英，徐雪松，楊照微，何成彥*，黃麗紅，王 海，周勁松

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗(yàn)科，吉林 長(zhǎng)春130033)

目的 探討APT5A1蛋白在大腸癌及癌旁組織的表達(dá)及其意義。方法 應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)大腸癌及癌旁組織進(jìn)行差異蛋白的分析檢測(cè)，并用免疫印跡驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。結(jié)果 對(duì)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)APT5A1蛋白在大腸癌組織中的表達(dá)水平低于癌旁組織，免疫印跡確認(rèn)其準(zhǔn)確性。結(jié)論 ATP5A1蛋白的低表達(dá)可能與大腸癌的癌變有密切的關(guān)系。

APT5A1蛋白；液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)；大腸癌

(ChinJLabDiagn,2016,20:1979)

大腸癌(CRC)是最常見的消化系統(tǒng)的腫瘤，已經(jīng)成為全世界醫(yī)療保健的問題[1]。有專家預(yù)測(cè)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率在我國(guó)今后很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)將穩(wěn)步上升，成為我國(guó)發(fā)病率上升最快的惡性腫瘤之一[2]。因其惡性程度高，容易發(fā)生淋巴道及血道轉(zhuǎn)移，就診時(shí)已經(jīng)有15%-35%的患者發(fā)生轉(zhuǎn)移，喪失了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)[3],而早期無淋巴轉(zhuǎn)移者術(shù)后五年生存率卻可達(dá)90%[4]。所以大腸癌的早期治療能明顯改善患者的生存率，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療一直是大腸癌研究的熱點(diǎn)。大腸癌早期診斷指標(biāo)的尋找及其發(fā)病機(jī)制的研究一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者們關(guān)注的問題。外國(guó)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)ATP5A1基因與結(jié)直腸癌的發(fā)病有關(guān)，但主要是在基因水平上探討腫瘤發(fā)生的可能機(jī)制，而對(duì)ATP5A1蛋白質(zhì)水平上的研究比較少，所以本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來探索ATP5A1蛋白在大腸癌及癌旁組織的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1．1 組織來源

本實(shí)驗(yàn)所用組織標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為大腸癌腺癌，癌旁組織標(biāo)本均取自癌組織邊緣上端10 cm外處的正常組織，取材前患者未經(jīng)任何治療。在上述標(biāo)準(zhǔn)下，收集吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院經(jīng)外科手術(shù)治療切除的大腸癌及配對(duì)的癌旁組織標(biāo)本18例，生理鹽水即時(shí)沖洗干凈，放置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及儀器

二硫蘇糖醇(DTT),TMED,碘乙酰胺(IAA),十二烷基硫酸鈉(SDS)均購(gòu)于美國(guó)GE公司，DNA酶，RNA酶，胰蛋白酶(測(cè)序級(jí))，考馬斯亮藍(lán)-G250、苯甲基磺酰氟 (PMSF)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，蛋白質(zhì)定量試劑盒，尿素購(gòu)自Bio-Rad公司，納升級(jí)毛細(xì)管高效液相色譜-電噴霧離子肼質(zhì)譜儀為美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 提取組織蛋白及測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 取50 mg組織充分研磨制成勻漿，低溫離心留取上清備用?？捡R斯亮藍(lán)染色,于595 nm處檢測(cè)蛋白吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品蛋白含量及吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析組織中的蛋白質(zhì)濃度。

1.3.2 組織蛋白水解制備多肽混合物 將提取的組織蛋白用一定濃度的NH4HCO3溶解稀釋，以降低組織蛋白中的尿素濃度。用DTT調(diào)定其終濃度至20 mmol/L,56℃避光放置1 h,還原蛋白質(zhì)中被氧化失活的-SH基團(tuán)。將反應(yīng)體系降至室溫，加入1M的IAA混勻后調(diào)定其終濃度為50 mmol/L,避光反應(yīng)30 min。按照1∶50(胰酶：蛋白質(zhì))的比例向反應(yīng)體系中加入測(cè)序級(jí)的胰酶，37 ℃酶切水浴孵育過夜。酶切樣品分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用鑒定蛋白質(zhì)組成及數(shù)據(jù)庫(kù)檢索分析 用Buffer A溶液將樣品溶解，各取50 μg的樣品進(jìn)行色譜上樣，樣品先進(jìn)入低流速柱然后再經(jīng)高流速柱進(jìn)行洗脫。將洗脫的多肽用LTQXL離子肼質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，選擇合適的核質(zhì)比檢測(cè)范圍，數(shù)據(jù)依賴方式二級(jí)全掃描。應(yīng)用Thermo Fisher公司的Bioworks3.3.1SP1 軟件，使用SEQUEST算法在數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)的檢索，尋找與其匹配的蛋白質(zhì)和多肽，從而鑒定出相關(guān)的差異蛋白。

1.3.4 免疫印跡確證試驗(yàn) 對(duì)選定的目標(biāo)蛋白ATP5A1進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)，進(jìn)一步的驗(yàn)證該蛋白的在大腸癌及癌旁組織的表達(dá)情況。ATP5A1單克隆抗體購(gòu)自的美國(guó)Abgent公司，內(nèi)參抗體為β-Actin。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 組織蛋白酶解產(chǎn)物的二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析

本研究采用譜圖數(shù)來評(píng)價(jià)兩組樣品中同一個(gè)蛋白質(zhì)的豐度，對(duì)于豐度發(fā)生變化的蛋白質(zhì)，譜圖數(shù)需要滿足以下條件：(1)兩個(gè)樣品中譜圖數(shù)的比值大于等于1；(2)兩個(gè)樣品中譜圖數(shù)的差值大于等于72。通過具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(每組至少做三次檢測(cè))的比較分析，得到大腸癌與癌旁組織的差異蛋白44個(gè)，在癌組織中表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)21個(gè)，下調(diào)蛋白23個(gè)，目標(biāo)下調(diào)表達(dá)蛋白ATP5A1的質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 ATP5A1的質(zhì)譜圖

2.2 免疫印跡驗(yàn)證ATP5A1在大腸癌組織與癌旁組織的表達(dá)情況

用Western blot檢測(cè)大腸癌及癌旁組織中ATP5A1蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明ATP5A1蛋白在大腸癌中的表達(dá)水平明顯低于配對(duì)的癌旁組織，此結(jié)果進(jìn)一步的驗(yàn)證了二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用鑒定差異蛋白ATP5A1的準(zhǔn)確性。結(jié)果見圖2。

圖2 ATP5A1的免疫印跡圖

3 討論

大腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，在這一過程中必然伴隨著蛋白質(zhì)的變化。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)成為大腸癌研究中重要工具，可以高通量、大規(guī)模的分析腫瘤組織蛋白與正常組織蛋白，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)在表達(dá)量上的差異，從而篩選出與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，而這種蛋白質(zhì)則可能成為腫瘤早期診斷的新的生物學(xué)標(biāo)志物[5]。

ATP5A1基因編碼ATP合酶的α-亞基，而ATP合酶則是位于線粒體上由16個(gè)蛋白質(zhì)亞基組成的多亞基復(fù)合體，參與氧化磷酸化中ATP的合成和分解，而其α-亞基主要是參與質(zhì)子的傳遞。ATP5A1基因位于人類的第18號(hào)染色體上，有研究證實(shí)該基因的失活會(huì)導(dǎo)致ATP合酶復(fù)合體的失活，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Warburg假說認(rèn)為，癌組織細(xì)胞由于線粒體功能受損，導(dǎo)致糖酵解的速率增加。之后該假說被不同類型的腫瘤證實(shí)了其正確性。有研究證實(shí)，在結(jié)腸癌中已經(jīng)檢測(cè)到了ATP5A1的低表達(dá)，然而這種低表達(dá)可能有助于結(jié)腸癌細(xì)胞獲得對(duì)5-氟尿嘧啶的抵抗力[6]。而且ATP5A1基因的缺失與結(jié)直腸癌的低存活率相關(guān)，ATP5A1基因的低表達(dá)可能是臨床結(jié)直腸癌不良預(yù)后的一個(gè)生物標(biāo)志[7]。根據(jù)大腸癌遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制將大腸癌分為兩類，染色體不穩(wěn)定性型(CIN)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定型(MSI)，ATP5A1基因在CIN中的表達(dá)水平高于MSI中的表達(dá)水平，而這種低表達(dá)的ATP5A1可能會(huì)促進(jìn)MSI型腫瘤的發(fā)展[8]。所以ATP5A1蛋白的低表達(dá)可能對(duì)大腸癌腫瘤的分型和及預(yù)測(cè)患者的預(yù)后中會(huì)有一定的指向作用。

目前關(guān)于ATP5A1蛋白在惡性腫瘤中的研究不多，張景萍[9]等使用二維凝膠電泳和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)到了ATP5A1蛋白在食管癌中的上調(diào)表達(dá)，

林河春[10]等使用iTRAQ技術(shù)發(fā)現(xiàn)ATP5A1在高轉(zhuǎn)移肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平低于低轉(zhuǎn)移的肺腺癌細(xì)胞，提示ATP5A1蛋白的低表達(dá)可能跟腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)，梁燕[11]等發(fā)現(xiàn)差異蛋白ATP5A1在鼻咽癌中也表達(dá)，可能成為鼻咽癌放射治療的靶點(diǎn)。盡管在不同的腫瘤中ATP5A1的表達(dá)情況有一定的差異，但都說明了ATP5A1蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有一定的提示作用。本研究采用液質(zhì)聯(lián)用及蛋白質(zhì)印跡技術(shù)闡明了ATP5A1蛋白在大腸癌及癌旁組織的表達(dá)情況，證實(shí)了癌旁組織中的表達(dá)的ATP5A1蛋白量明顯高于大腸癌組織，提示在癌變組織ATP5A1可能扮演了癌癥抑制因子的角色。由于蛋白質(zhì)檢測(cè)的方便和穩(wěn)定性，所以ATP5A1蛋白可能會(huì)成為大腸癌早期診斷的新的分子標(biāo)志物，但是究竟能不能應(yīng)用于臨床還需要進(jìn)一步的研究。

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Expression and Significance of ATP5A1 in Colorectal Cancer

XIEChun-ying,XUEXue-song,YANGZhao-wei,etal.

(China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Objective To investigate the expression and significance of ATP5A1 in colorectal cancer tissue and tissue adjacent to carcinoma.Methods Two-dimensional chromatography and mass spectrometry method were applied to identifying the difference of protein expressed in colorectal cancer and carcinoma tissue adjacent,using western blot method to verify its accuracy.Results Dentifying the different protein spots,we found that ATP5A1 protein expressed significantly lower in colorectal cancer than that in the tissue adjacent to carcinoma,and then further confirmed its accuracy by western blot.Conclusion The decrease of ATP5A1 expression may be have a closely relationship with colorectal cancer.

APT5A1 ptotein;Two-dimensional chromatography and mass spectrometry;colorectal cancer

國(guó)家自然基金資助項(xiàng)目(81572082)；吉林省科技廳資助項(xiàng)目(2014041005GH，20140311092YY，20150101153，20150414015)

1007-4287(2016)12-1979-03

R735.3

A

2016-04-12)

*通訊作者