溫 晶 王 川 孫樂樂 陳明飛,2 付希安 王建文,2 劉 紅,2 張福仁,2

·技術與方法·

麻風分枝桿菌qPCR鑒定方法的建立及評價

溫 晶1王 川1孫樂樂1陳明飛1,2付希安1王建文1,2劉 紅1,2張福仁1,2

目的： 建立麻風分枝桿菌qPCR鑒定方法并評價該方法的敏感性和特異性。方法： 應用qPCR對135例麻風及其他疾病組織蠟塊樣本中麻風分枝桿菌特異性基因Ag85B和SodA進行檢測，建立結果判定標準；對99例病種未知組織臘塊樣本和89例病種未知新鮮皮膚組織樣本以qPCR檢測麻風特異性基因Ag85B和SodA，評價該檢測方法的特異性和敏感性。結果： qPCR技術檢測新鮮皮膚組織麻風特異性基因Ag85B和SodA的特異性和敏感性分別為100%和91.7%，高于組織蠟塊樣本。結論： qPCR技術可用于麻風菌的檢測。

麻風； 麻風分枝桿菌； qPCR； 評價

麻風(leprosy)是麻風分枝桿菌感染易感個體，特異性侵犯皮膚和周圍神經組織，晚期可致殘的一種慢性傳染病，可根據(jù)查菌指數(shù)分為多菌型(multibacillary, MB)和少菌型(paucibacillary, PB)兩個亞型[1]。該病曾在全球廣泛流行，嚴重危害人民的身心健康。目前全球每年仍有逾20萬的新登記病例，我國每年新登記病例數(shù)始終在1000例左右[2,3]。

由于麻風分枝桿菌無法體外培養(yǎng)，此病的診斷主要為組織涂片查菌結合組織病理學與臨床表現(xiàn)的方法。有報道顯示，每克組織中含有104個病原菌才能通過抗酸染色的方式被檢測到，足以說明查菌方式靈敏度的不足[4,5]。同時，抗酸染色的原理基于分枝桿菌中的分枝菌酸與染料的結合而顯色，沒有種屬的特異性，存在誤診的可能性[6]。傳統(tǒng)組織病理學依據(jù)組織形態(tài)學改變，如肉芽腫病變、有無明顯“浸潤帶”特點等，在缺乏典型的組織形態(tài)特點時往往難以確診，不能及時有效地為臨床治療提供有力的診斷依據(jù)。

近年來，將實時熒光定量與普通 PCR技術相結合的qPCR 技術的快速發(fā)展，以其能夠對目標微生物進行特異性定量及定性檢測，已被成功用于微生物快速檢測[7,8]。麻風分枝桿菌基因組中種屬特異性的36kDa抗原、18kDa抗原、65kDa抗原、groEL、Ag85B、SodA、16S rRNA基因為此方法在檢測麻風分枝桿菌中的應用提供了基礎[9-14]。

本研究旨在以特異性基因為基礎，建立麻風分枝桿菌qPCR檢測技術，然后通過對其靈敏度和特異度進行評價，為臨床上輔助麻風診斷提供一種快捷有效的手段。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 蠟塊組織樣本 均來自我院病理科蠟塊組織樣本庫，選取1990-2009年麻風患者85例，其中多菌型(MB)65例，少菌型(PB)20例，其他疾病患者50例。以上樣本用于qPCR方法建立。再次選取蠟塊組織99例，所選病例疾病未知，用于qPCR方法靈敏性與特異性評價。所有組織均切取厚度為8 μm蠟片，每例組織切取8片。上述麻風的診斷均符合國家GB15973-1995麻風診斷標準和分型標準。

1.1.2 臨床病例組織樣本 皮損組織樣本(6 mm3)均來自2014-2015年我院門診疑似麻風患者，共計89例。以上該研究的參與者均簽署了知情同意書。

1.2 組織DNA的提取

1.2.1 蠟塊組織DNA的提取 切取的8片組織蠟片立即放置于1.5 mL滅菌EP管中，然后向管中加入1 mL二甲苯中，充分溶解并置換石蠟。棄去上清后加入30 μL蛋白酶K，90℃條件下解交聯(lián)裂解組織，然后按照蠟塊組織DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)操作說明書進行操作，最后DNA溶解于TE緩沖液中備用。

1.2.2 皮損組織DNA的提取 臨床收取的新鮮皮損組織(6 mm3)在生物安全柜中利用手術刀片切成很小的碎塊，將組織碎塊轉移至1.5 mL無菌EP管中加入30 μL蛋白酶K，56℃條件下裂解組織，然后按照組織和全血DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)操作說明書進行操作，最后DNA溶解于TE緩沖液中備用。

1.3 麻風分枝桿菌qPCR檢測 以麻風分枝桿菌特異性基因Ag85B和SodA為檢測目標，利用Primer Expess 3.0設計引物及探針。PCR反應體系體積為30 μL，其中包括2xTaqMan Gene Expression Mater Mix15 μL，20 μM上下游引物各0.75 μL，10 μM Taqman探針0.6 μL，模板DNA 2 μL，退火溫度為60℃，擴增循環(huán)數(shù)為40，利用ABI 7300熒光定量PCR系統(tǒng)(美國應用生物系統(tǒng)公司)進行檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法 麻風分枝桿菌檢出率，qPCR靈敏性及特異性等數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件完成。

2 實驗結果

2.1 麻風蠟塊組織檢出率及實驗結果的判定 以50份其他疾病蠟塊組織中qPCR擴增結果無1例陽性即保證特異性為100%同時最大可能提高靈敏性為原則，同時參考以往同類文獻報道[15],將麻風分枝桿菌qPCR檢測臨界擴增Ct值定為35，判讀標準為，當Ag85B和SodA擴增Ct值均≤35時，結果判定為陽性，當Ag85B和SodA擴增Ct值均>35時，結果判定為陰性，若出現(xiàn)一個基因擴增Ct值≤35而另一個基因擴增Ct值>35時，則重新檢測，根據(jù)重新檢測的結果按照上述標準再進行判讀。基于以上標準，麻風患者的總體檢出率為82.4%，其中MB型患者的檢出率為89.2%，PB型患者的檢出率為60%見表1。檢測陰性的麻風患者樣本中，有5例MB型患者(占檢測陰性MB型樣本的71.4%)和3例PB型患者(占檢測陰性PB型樣本的37.5%)出現(xiàn)了PCR擴增，但是Ct值>35，綜上可見，MB型患者的檢出率高于PB型患者，且年代越近的樣本的檢出率越高，原因可能為蠟塊組織保存時間過長造成了病原體DNA的降解，影響了檢出率。

表1 麻風蠟塊組織中qPCR技術檢出率

2.2 qPCR方法在蠟塊樣本中的靈敏性及特異性分析 qPCR方法檢測病種未知的99例蠟塊組織樣本，麻風分枝桿菌陽性樣本為25例，陰性樣本74例；99例蠟塊組織樣本的病理結合查菌診斷為28例麻風，其余為其他疾病，經對比分析，該方法的檢測敏感性為82.1%，特異性為97.2%(表2)。由于蠟塊組織保存時間較長及蛋白交聯(lián)給組織裂解帶來的困難，我們推測該方法在新鮮皮損組織中敏感性和特異性會更高。

表2 蠟塊組織中qPCR技術靈敏性及特異性分析

2.3 qPCR方法在新鮮皮膚樣本中的靈敏性及特異性分析 2014-2015年，我院門診共收集89例疑似麻風患者皮損組織，利用qPCR技術對其均進行了麻風分枝桿菌檢測，為消除檢測的偏向性，均在病理診斷之前報告檢測結果。根據(jù)之前制定的檢測結果判讀標準，判定麻風分枝桿菌陽性樣本33例，陰性樣本56例；89例臨床組織樣本病理診斷為36例麻風，53例為其他疾病，具體對比分析結果見表3?？梢?，qPCR技術在新鮮臨床病例樣本的檢測靈敏度為91.7%，特異度為100%。

表3 新鮮皮膚組織中qPCR技術靈敏性及特異性分析

3 討論

麻風分枝桿菌不能體外培養(yǎng)，給臨床上麻風的診斷帶來了較大困難。麻風診斷標準為：①有皮損并伴有淺感覺障礙及閉汗；②周圍神經干或皮支粗大；③皮膚切刮組織液及皮膚病理抗酸染色見麻風分枝桿菌；④病理檢查見上皮樣細胞肉芽腫及巨噬細胞肉芽腫，神經可見腫大及浸潤。符合前2項疑似麻風，符合以上4項即可確診[16]。以上可見，麻風的診斷最核心的指標為查見麻風分枝桿菌和典型的病理表現(xiàn)。對于早期或者PB型麻風，傳統(tǒng)的抗酸染色由于受其靈敏度限制查見病原菌比較困難，雖然為了提高該方法的靈敏度，諸如使用特殊包被的載玻片，改良的染色步驟及校準的顯微鏡等措施被使用，但是特異性方面的缺陷，限制了其在臨床診斷的應用[17，18]；對于缺乏典型病理表現(xiàn)的病例，病理檢查也不能及時提供明確的診斷依據(jù)。此外，利用酶聯(lián)免疫反應(ELISA)技術檢測機體針對酚糖脂的IgM抗體等血清學檢查手段也被用以麻風的輔助診斷[19，20]，該方法是非侵入性的且對抗酸染色檢查是一種有效的補充。此方法的檢測結果反映的是機體的病原菌載量，可根據(jù)其結果對麻風患者作進一步的細化分型[21]。但是，PCR技術，特別是qPCR技術已經被證明在靈敏度方面相對于血清學檢查有著無可比擬的優(yōu)勢[22]。

本研究選取麻風分枝桿菌特異性基因Ag85B和SodA作為檢測目標，設計特異性引物及探針，對前期85例麻風蠟塊組織樣本(65例MB型和20例PB型)和50例其他疾病蠟塊組織樣本進行檢測，根據(jù)檢測PCR的擴增結果及充分保證特異性并最大可能提高靈敏性的原則，我們將PCR擴增臨界Ct值定為35。按照此標準，85例麻風蠟塊組織樣本檢出率為82.4%。然后，我們檢測了病種未知的99例蠟塊組織樣本的麻風分枝桿菌，將判讀結果與臨床診斷結果進行比對后，計算出qPCR方法的特異度為97.2%，靈敏度為82.1%。接下來在89例新鮮皮損組織中進行了麻風分枝桿菌檢測，經比對計算后，特異度為100%，靈敏度為91.7%，其中多菌型的靈敏度達100%，而少菌型的靈敏度為50%。以上結果證實了我們對蠟塊組織中靈敏度偏低原因的推測；同時，我們的上述研究結果與國內外研究團隊研究結果基本保持一致。葉理等[24]利用qPCR方法在52例皮膚組織標本中檢測麻風分枝桿菌DNA的檢出率為90.38%；覃曉琳等[25]利用單管巢式qPCR在54例疑似麻風組織液標本中檢測麻風分枝桿菌DNA，其中多菌性的檢出率為96.9%，少菌型檢出率為83.3%。另外，Martinez等[15]于2006年利用qPCR技術在69例皮膚組織樣本中檢測麻風分枝桿菌Ag85B基因的靈敏度達91.3%；而后于2011年再次利用qPCR技術在62例皮膚組織樣本中同時檢測麻風分枝桿菌Ag85B基因和SodA基因，其靈敏度分別為68.8%和75%；對于Ag85B基因，多菌型的靈敏度為95.2%，而少菌型的靈敏度為36.4%[23]。

本研究結果表明，同時選取麻風分枝桿菌特異性基因Ag85B和SodA作為檢測目標的qPCR技術，具有較高的靈敏度和最高的特異度；輔之以蛋白酶K裂解為核心的麻風分枝桿菌DNA提取方法，是一種快捷有效的臨床診斷麻風的輔助手段，特別是對于BT型麻風和缺乏典型組織形態(tài)學改變的麻風診斷則意義更為明顯。

[1]Bennett BH, Parker DL, Robson M. Leprosy: steps along the journey of eradication[J]. Public Health Rep,2008,123(2):198-205.

[2]Goulart LR, Goulart IM. Leprosy pathogenetic background: a review and lessons from other mycobacterial diseases[J]. Arch Dermatol Res,2009,301(2):123-137.

[3]WHO. Global leprosy situation[J]. Weekly Epidemiological Record,2010,85:337-348.

[4]Shepard CC, McRae DH. A method for counting acid-fast bacteria[J]. Int J Lepr Other Mycobact Dis,1968,36:78-82.

[5]Williams DL, Gillis TP, Fiallo P. Detection of Mycobacterium leprae and the potential for monitoring antileprosy drug therapy directly from skin biopsies by PCR[J]. Molecular & Cellular Probes,1992,4:401-410.

[6]譚笑.結核病實驗室快速診斷方法的研究[J].湖南師范大學學報(醫(yī)學版),2007,4(2):58- 59.

[7]Harris KA, Turner P, Green EA. Duplex real-time PCR assay for detection of streptococcus pneumoniae in clinical samples and determination of penicillin susceptibility[J]. J Clin Microbiol,2008,46(8):2751-2758.

[8]Espy MJ, Uhl JR, Sloan LM. Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing[J]. Clin Microbiol Rev,2006,19(1):165-256.

[9]De Wit MYL, Faber WR, Krieg SR, et al. Application of a polymerase chain reaction for the detection of Mycobacterium leprae in skin tissues[J]. J Clin Microbiol,1991,29(5):906-910.

[10]Hartskeerl RA, De Wit MYL, Klatser PR. Polymerase chain reaction for the detection of Mycobacterium leprae[J]. J Gen Microbiol,1989,135:2357-2364.

[11]Williams DL, Gillis TP, JBooth R, et al. The use of a specific DNA probe and polymerase chain reaction for the detection of Mycobacterium leprae[J]. J Infect Dis,1990,162:193-200.

[12]Plikaytis BB, Gelber RH, Shinnick TM. Rapid and sensitive detection of Mycobacterium leprae using a nestedprimer gene amplification assay[J]. J Clin Microbiol,1990,28:1913-1917.

[13]Woods SA, Cole ST. A rapid method for the detection of potentially viable Mycobactenium leprae in human biopsies: a novel application of PCR[J]. FEMS Microbiol Lett,1989,65:305-310.

[14]Woods SA, Cole ST. A family of dispersed repeats in Mycobactenium leprae[J]. Mol Microbiol,1990,4:1745-1751.

[15]Martinez AN, Britto CF, Nery JA, et al. Evaluation of real-time and conventional PCR targeting complex 85 genes for detection of Mycobacterium leprae DNA in skin biopsy samples from patients diagnosed with leprosy[J]. J Clin Microbiol,2006,44(9):3154-3159.

[16]Jardim MR, Antunes SLG, Santos AR. Criteria for diagnosis of pure neural leprosy[J]. J Neurol,2003,250(7):806-809.

[17]Levy L, Ji B. The mouse foot-pad technique for cultivation of Mycobacterium leprae[J]. Lepr Rev,2006,77:5-24.

[18]Job CK, Chacko CJG. A modification of Fite's stain for demonstration of Mycobacterium leprae in tissue sections[J]. Indian Journal of Leprosy,1986,57:17-18.

[19]Torres P, Camarena JJ, Gomez JR, et al. Comparison of PCR mediated amplification of DNA and the classical methods for detection of Mycobacterium leprae in different types of clinical samples in leprosy patients and contacts[J]. Lepr Rev,2003,74:18-30.

[20]Jardim MR, Antunes SL, Simons B, et al. Role of PGL-I antibody detection in the diagnosis of pure neural leprosy[J]. Lepr Rev,2005,76:232-240.

[21]Schuring RP, Moet FJ, Pahan D, et al. Association between anti-pGL-I IgM and clinical and demographic parameters in leprosy[J]. Lepr Rev,2006,77:343-355.

[22]Wichitwechkarn J, Karnjan S, Shuntawuttisettee S, et al. Detection of Mycobacterium leprae infection by PCR[J]. J Clin Microbiol,1995,33:45-49.

[23]Martinez AN, Ribeiro-Alves M, Sarno EN, et al. Evaluation of qPCR- based Assays for leprosy diagnosis directly in clinical specimens[J]. Plos Neglect Trop D,2011,5:1-8.

[24]葉理,呂志成,靳亞麗,等.麻風分支桿菌PCR檢測方法的優(yōu)化與應用[J].皮膚性病診療學雜志,2016,23:23-26.

[25]覃曉琳,黃進梅,薛耀華,等.單管巢式實時PCR檢測麻風桿菌方法的建立及初步應用[J].中國麻風皮膚病雜志,2014,30:579-582.

(收稿：2016-06-21 修回：2016-06-24)

Establishment and evaluation of quantitative PCR method for detection of Mycobacterium leprae DNA

WENJing1,WANGChuan1,SUNLele1,CHENMingfei1,2,FUXi'an1,WANGJianwen1,2,LIUHong1,2,ZHANGFuren1,2.

1.ShandongProvincialInstituteofDermatologyandVenereology,AcademyofMedicalSciences,Jinan250022,China; 2.ShandongProvincialDermatologyHospital,ShandongUniversity,Jinan250022,China

Correspondenceauthor:ZHANGFuren,E-mail:zhangfuren@hotmail.com

Objective: To establish the detection method of Mycobacterium leprae DNA using quantitative PCR (qPCR) and to analyze the sensitivity and specificity of qPCR in identifyingMycobacteriumlepraeDNA. Methods: The special gene sequences Ag85B and soda ofMycobacteriumlepraeDNA were detected in 135 formalin-fixed, paraffin-embedded skin tissues of leprosy or non-leprosy patients using qPCR to establish the criterion for this method. Then the special gene sequences Ag85B and sodA ofMycobacteriumlepraeDNA were also detected in 99 formalin-fixed, paraffin-embedded skin tissues of unknown disease and 89 frozen skin tissues of unknown diseases to evaluate the sensitivity and specificity of qPCR. Results: The specificity and sensitivity of qPCR were 100% and 91.7% in frozen skin tissues and higher than those in formalin-fixed, paraffin-embedded skin tissues. Conclusion: qPCR is an useful method in detectingMycobacteriumlepraeDNA.

leprosy;Mycobacteriumleprae; qPCR; evaluation

山東省自然科學基金青年基金(編號：ZR2013HQ041)

1山東省醫(yī)學科學院，山東省皮膚病性病防治研究所，濟南，250022

2山東省皮膚病醫(yī)院，山東大學，濟南，250022

張福仁，E-mail：zhangfuren@hotmail.com