張 霞，陳少秀，黃 萍，康曉晶，何華瓊

丹槐銀屑濃縮丸下調(diào)銀屑病模型豚鼠p21和p53基因的機(jī)制

張 霞1，陳少秀1，黃 萍1，康曉晶1，何華瓊2*

目的 建立豚鼠銀屑病模型，研究丹槐銀屑濃縮丸下調(diào)其p21和p53基因的機(jī)制。方法 將32只豚鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型組、阿維A組和丹槐組，采用RT-PCR法檢測表皮脫落病變組織凋亡相關(guān)基因p21、p53和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等的表達(dá)。結(jié)果 丹槐組表皮脫落病變組織凋亡相關(guān)基因p53蛋白、p53-mRNA、p21蛋白及p21-mRNA表達(dá)均下調(diào)，與模型組和阿維A組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；VEGF蛋白和VEGF-mRNA表達(dá)下調(diào)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 丹槐銀屑濃縮丸在治療尋常型銀屑病時(shí)，可能通過下調(diào) p21和p53表達(dá)來降低表皮細(xì)胞凋亡率，并且與抑制VEGF過度表達(dá)、減少病變組織皮下血管新生、重建而減輕尋常型銀屑病的病理進(jìn)程有關(guān)。

尋常型銀屑??；丹槐銀屑濃縮丸；p21；p53；血管內(nèi)皮生長因子

0 引言

尋常型銀屑病屬慢性炎癥性皮膚病，俗稱“牛皮癬”，具有易復(fù)發(fā)性、泛發(fā)性、頑固性的臨床特點(diǎn)[1]，銀屑病的病理改變以表皮細(xì)胞增殖過快和角化不全為主，其發(fā)病多與遺傳、自身免疫異常、內(nèi)分泌失調(diào)、炎癥反應(yīng)、精神或神經(jīng)因素有關(guān)[2]。研究表明，銀屑病病變表皮增生過度和角化不全與p21、p53高表達(dá)有明確的相關(guān)性[3]?；驒z測發(fā)現(xiàn)，脫落表皮的凋亡相關(guān)基因p21、p53高表達(dá)，且脫落表皮組織中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)也出現(xiàn)上調(diào)現(xiàn)象[4]。推測通過下調(diào)基因p21、p53抑制VEGF高表達(dá)有可能成為治療銀屑病的新途徑。近年來，中草藥在臨床治療銀屑病有突出表現(xiàn)，但目前對中藥治療銀屑病的機(jī)制缺乏系統(tǒng)研究，多局限于中醫(yī)理論探討。本實(shí)驗(yàn)以現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)方法對中草藥丸劑丹槐銀屑濃縮丸在治療銀屑病方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究，觀察丹槐銀屑濃縮丸影響凋亡相關(guān)基因p53、p21和VEGF的表達(dá)，以期為臨床治療銀屑病提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 豚鼠32只，體重386～327 g，雌雄各半，用隨機(jī)數(shù)字表先編號，然后隨機(jī)分為4組：空白對照組、模型組、阿維A組和丹槐組，每組8只。實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物許可證號：SYXK(鄂)2011-0031，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥品及試劑 丹槐銀屑濃縮丸(黑龍江省中醫(yī)研究院醫(yī)院研制，批號：090801)；普萘洛爾片(江蘇常州亞邦制藥有限公司，批號：040512)；阿維A膠囊(重慶華邦制藥有限公司，批號：1420007670)；p21、p53、VEGF蛋白測試試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：028451、028455、028457)。RT-PCR檢測p21-mRNA、p53-mRNA和VEGF-mRNA試劑及逆轉(zhuǎn)錄試劑(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：1601257、1601258、1601259)。

1.3 銀屑病造模方法 參照伍長娟等[5]方法，造模時(shí)動(dòng)物雙耳剃毛，用配制成5%的普萘洛爾水溶液均勻涂于模型組、阿維A組和丹槐組動(dòng)物雙側(cè)耳背處，以面積0.8～1.0 cm2、厚度1 mm為宜，1次/d，連續(xù)涂4周；空白對照組涂生理鹽水。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：雙耳涂藥處出現(xiàn)銀屑病樣皮損樣改變或有脫落表皮組織，用打孔針取樣進(jìn)行病理檢查發(fā)現(xiàn)表皮角質(zhì)層過度角化，釘突延長棘層變厚，真皮層出現(xiàn)中重度炎細(xì)胞浸潤，角質(zhì)層血管炎、內(nèi)有小膿腫等銀屑病性改變。結(jié)果顯示，模型組、阿維A組和丹槐組造模4周后均出現(xiàn)銀屑病樣皮損，成功率為100%。

1.4 治療方法 造模成功后，阿維A組用10%抗皮膚角化異常藥阿維A膠囊[10 mL/(kg·d)]灌胃給藥，丹槐組用配制成10%的丹槐銀屑濃縮丸灌胃[10 mL/(kg·d)]，空白對照組和模型組灌胃等體積生理鹽水，四組動(dòng)物均連續(xù)治療4周。治療過程中觀察動(dòng)物皮損部位病理改變，結(jié)束后取病變組織做病理學(xué)檢查。

1.5 檢測指標(biāo)與方法 參照文獻(xiàn)[6]，于治療前后分別取各組兔銀屑病樣皮損部位組織，采用ELISA法檢測p53、p21和VEGF蛋白表達(dá)，GEL-Pro Analyzer軟件分析治療前后p53、p21和VEGF的mRNA表達(dá)。PCR引物設(shè)計(jì)：上游5′-GCTCACGCACTCGGTGCTCA-3′，下游5′-CCAGGCTCCAGAAGAAGTTG-3；用上述引物擴(kuò)增兔DNA片段，再用SP-Max 3500FL型多功能熒光酶標(biāo)儀(上海閃譜生物科技有限公司，型號：3500FL)于450 nm波長下測定VEGF的OD值，對各組標(biāo)本提取總RNA，設(shè)計(jì)20 μL體系以AMV逆轉(zhuǎn)錄酶先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中獲得的cDNA模板1 μL、GAPDH為內(nèi)對照，再設(shè)計(jì)20 μL PCR擴(kuò)增體系，在PCR儀中94 ℃預(yù)變性5 min后，按94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外燈下拍照，記錄各條帶的吸收度。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物病理改變觀察 模型組、阿維A組、丹槐組在涂普萘洛爾造模4周后，表皮均出現(xiàn)明顯的皮損等病理學(xué)特征，如表皮脫落紅丘疹等類似于人類銀屑病樣改變。用打孔針取樣進(jìn)行病理檢查證實(shí)發(fā)現(xiàn)，表皮角質(zhì)層過度角化，釘突延長棘層變厚，真皮層出現(xiàn)中重度炎細(xì)胞浸潤及角質(zhì)層血管炎、內(nèi)有小膿腫等銀屑病性改變，提示造模方法可行，造模成功。在治療4周后，空白對照組無病理改變，模型組所有癥狀加重。阿維A組皮損消失，表皮角化現(xiàn)象明顯減少，幾乎無炎細(xì)胞浸潤、表皮釘突及小膿腫消退。丹槐組與阿維A組類似，皮損面積減小，但病理檢查仍有部分動(dòng)物表皮有角化現(xiàn)象，角質(zhì)層血管炎、小膿腫等較模型組及治療前明顯好轉(zhuǎn)。

2.2 丹槐銀屑濃縮丸對豚鼠表皮脫落病變組織p53蛋白、p53-mRNA、p21蛋白、p21蛋白、p21-mRNA表達(dá)的影響 空白對照組豚鼠表皮脫落病變組織p53、p21蛋白有少量表達(dá)，治療前后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組造模后表皮脫落病變組織p53蛋白、p53-mRNA、p21蛋白、p21-mRNA高表達(dá)，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，治療前后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；阿維A組治療前后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療4周后，丹槐組與模型組、阿維A組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.3 丹槐銀屑濃縮丸對實(shí)驗(yàn)性銀屑病豚鼠表皮脫落病變組織VEGF蛋白表達(dá)的影響 空白對照組豚鼠表皮脫落病變組織VEGF蛋白有少量表達(dá)，治療前后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組造模后VEGF蛋白和VEGF-mRNA高表達(dá)，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療4周后，阿維A組與治療前、模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療4周后，丹槐組與模型組、阿維A組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1 豚鼠表皮脫落病變組織p53、p21蛋白表達(dá)

注：*與空白對照組比較，P<0.05；#與治療前比較，P<0.05；△與模型組比較，P<0.05；▲與阿維A組比較，P<0.05

表2 豚鼠表皮脫落病變組織VEGF蛋白表達(dá)

注：*與空白對照組比較，P<0.05；#與治療前比較，P<0.05；△與模型組比較，P<0.05；▲與阿維A組比較，P<0.05

3 討論

既往研究表明，銀屑病發(fā)病多系外邪化熱入血造成機(jī)體過度反應(yīng)，血熱、血瘀、血燥病癥并存乃現(xiàn)風(fēng)熱濕之象[7]。該病治療有“治風(fēng)先治血，血行風(fēng)自滅”的觀點(diǎn)，丹槐銀屑濃縮丸由丹參、槐花、柴草、赤芍、黃連、雞血藤地黃、白鮮皮、高青葉等諸藥調(diào)制成丸，具有清熱解毒、涼血活血、祛風(fēng)止癢之功效[8]。

銀屑病的發(fā)病機(jī)制目前尚無定論，研究表明，p53和p21是抑癌機(jī)制的關(guān)鍵基因之一，參與腫瘤進(jìn)展、抑制細(xì)胞生長的生理進(jìn)程，銀屑病時(shí)二者呈高表達(dá)[9]。p53、p21主要參與銀屑病角質(zhì)細(xì)胞增殖，二者高表達(dá)加劇過度角質(zhì)細(xì)胞增殖[10]。p21高表達(dá)抑制細(xì)胞周期依賴性激酶的活性，并可能直接抑制DNA復(fù)制和細(xì)胞凋亡，使皮損加重[11]。p53是p21的下游基因，與p21存在顯著正相關(guān)。兩者在病理組織中的表達(dá)改變程度均與細(xì)胞增生程度有關(guān)。本研究顯示，p53和p21在異常增生的表皮皮損組織中出現(xiàn)高表達(dá)。兩者可能有協(xié)同作用，調(diào)控局部細(xì)胞周期性凋亡，并相互促進(jìn)，共同干擾正常細(xì)胞代謝并最終促使表皮皮損細(xì)胞增殖，加重銀屑病癥狀。本研究中阿維A組為陽性對照。阿維A為抗皮膚角化異常藥，是臨床治療銀屑病的主要藥物，其藥理作用主要是抑制T細(xì)胞增殖及表皮Ⅰ型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞分化，同時(shí)抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、皮脂過度分泌，減輕皮損處的炎性反應(yīng)，緩解皮損處的瘙癢及疼痛[12]。結(jié)果顯示，阿維A有治療作用，但其機(jī)制與下調(diào)p53、p21無關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，治療前(造模4周)，模型組、阿維A組和丹槐組p53、p21在表皮脫落病變組織中呈高表達(dá)，在空白對照組正常表皮中幾乎不表達(dá)。表明p53、p21含量與細(xì)胞異常增生程度有關(guān)，也與病變細(xì)胞的異常增殖及因此而導(dǎo)致的功能紊亂和病程密切相關(guān)，與以往研究相符[13]。治療4周后，丹槐組表皮脫落病變組織凋亡相關(guān)基因p53蛋白、p53-mRNA、p21蛋白、p21-mRNA表達(dá)均下調(diào)，與模型組和阿維A組有顯著差異。提示丹槐銀屑濃縮丸通過下調(diào)患者p53、p21，最終降低細(xì)胞異常增生，提高角質(zhì)細(xì)胞凋亡率，使皮損恢復(fù)正常外觀。此外，丹槐組VEGF蛋白和VEGF-mRNA表達(dá)下調(diào)，與模型組比較有顯著差異。除空白對照組外，治療前(造模4周)，其他三組VEGF及VEGF-mRNA在表皮脫落病變組織中高表達(dá)。VEGF是一種高度特異性的促血管生長因子，有學(xué)者認(rèn)為，銀屑病是由自分泌型 VEGF增多造成的[14]，此觀點(diǎn)在本研究模型組中得以驗(yàn)證，模型組治療前后VEGF及VEGF-mRNA在表皮脫落病變組織中均出現(xiàn)高表達(dá)，且治療前后有顯著差異。提示銀屑病的發(fā)病機(jī)制與表皮及真皮下VEGF、VEGF-mRNA上調(diào)有關(guān)，VEGF可能通過刺激真皮乳頭微血管的異常增生進(jìn)而加重銀屑病發(fā)生發(fā)展，導(dǎo)致嚴(yán)重皮損，與朱凡等[15]研究結(jié)果一致。在正常情況下，機(jī)體VEGF、VEGF-mRNA有少量表達(dá)；當(dāng)機(jī)體抵抗力下降、免疫異常、炎癥刺激，尤其在出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，可能破壞VEGF及VEGF-mRNA而使其過度表達(dá)[16]。治療4周后，丹槐組VEGF蛋白、VEGF-mRNA表達(dá)下調(diào)，提示丹槐銀屑濃縮丸也有降低VEGF蛋白和VEGF-mRNA的作用，可減少病變組織皮下血管新生、重建，進(jìn)而減輕尋常型銀屑病的病理進(jìn)程。

總之，p53、p21高表達(dá)與尋常型銀屑病的病理改變和病理進(jìn)程確有相關(guān)性，特別是p53在尋常型銀屑病皮損中高表達(dá)是造成皮損的關(guān)鍵，其在病理組織中的表達(dá)改變程度均與細(xì)胞增生的程度呈正相關(guān)[9]。丹槐銀屑濃縮丸通過涼血活血、清熱解毒、祛風(fēng)止癢而發(fā)揮治療銀屑病的功效，可能與其下調(diào)p21、p53表達(dá)而降低表皮細(xì)胞凋亡率，抑制VEGF過度表達(dá)，減少病變組織皮下血管新生、重建，進(jìn)而減輕病理進(jìn)程有關(guān)。

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Mechanism of Danhuaiyinxie concentrated pill in down-regulating p21 and p53 gene of psoriasis guinea pig model

ZHANG Xia1,CHEN Shao-xiu1,HUANG Ping1,KANG Xiao-jing1,HE Hua-qiong2*

(1.Affiliated Hospital of Hubei Medical College,Shiyan Taihe Hospital,Shiyan 442000,China;2.Function Laboratory of Hubei Medical College,Shiyan 442000,China)

Objective To establish a guinea pig model of psoriasis and research the mechanism of Danhuaiyinxie concentrated pill in down-regulating p21 and p53 gene.Methods Totally 32 guinea pigs were randomly divided into blank control group,model group,Avia group and Danhuai group,and the epidermal-shedding-lesions-apoptosis-related genes (p53 and p21) and the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) was detected by RT-PCR.Results The expression of epidermal-shedding-lesions-apoptosis-related gene p53 protein,p53-mRNA,p21 protein and p21-mRNA in Danhuai group was down-regulated compared with model group or Avia group (P<0.05);the expression of VEGF protein and VEGF-mRNA was down-regulated compared with model group (P<0.05).Conclusion Danhuaiyinxie concentrated pill can down-regulate the expression of p21 and p53 to decrease the apoptosis rate of epidermal cells in the treatment of psoriasis vulgaris,and inhibit the over-expression of VEGF,reduce the angiogenesis and reconstruction of lesion tissue to alleviate the pathological process of psoriasis vulgaris.

Psoriasis vulgaris;Danhuaiyinxie concentrated pill;p21;p53;Vascular endothelial growth factor

2016-05-30

1.湖北省十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)皮膚科，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，湖北 十堰 442000

湖北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(D20122402)

10.14053/j.cnki.ppcr.201612004

*通信作者