申 甜，雷 濤，徐碧林，陳 琳，章志建

二甲雙胍對(duì)NAFLD大鼠肝臟脂聯(lián)素/SIRT1 mRNA表達(dá)的影響

申 甜，雷 濤*，徐碧林，陳 琳，章志建

目的 觀察二甲雙胍對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD大鼠肝臟脂聯(lián)素和SIRT1基因表達(dá)的影響，探討其潛在的機(jī)制。方法 將34只SD大鼠隨機(jī)分為2組：對(duì)照組(NC組，12只，給予普通飼料)、高脂組(HF組，22只，給予高脂飲食)，喂養(yǎng)8周后兩組各隨機(jī)抽取6只；證實(shí)NAFLD模型建立后，將剩余HF組大鼠隨機(jī)分為二甲雙胍干預(yù)組(HF+M組，8只)、高脂組(HF1組，8只)及對(duì)照組(NC1組，6只),均給予等體積生理鹽水，灌胃8周后,測(cè)定空腹血糖(FBG)、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、游離脂肪酸(FFA)及肝臟TG含量，測(cè)定胰島素(FINS)水平，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)；HE染色觀察肝臟病理形態(tài)學(xué)變化；采用Real-time PCR法檢測(cè)肝組織脂聯(lián)素、SIRT1、AMPK-α mRNA表達(dá)。結(jié)果 高脂喂養(yǎng)8周后,HF組大鼠NAFLD模型建立，伴明顯胰島素抵抗。HF+M組大鼠血清TC、TG、FFA、FBG、ALT、AST、肝臟TG含量及HOMA-IR低于HF1組(P<0.05)，血清脂聯(lián)素較HF1組升高(P<0.05)，肝臟脂肪變較HF1組有所改善；與HF1組比較，HF+M組肝臟SIRT1、AMPK-α mRNA表達(dá)增加(P<0.05)。結(jié)論 二甲雙胍可減輕NAFLD大鼠胰島素抵抗及肝臟TG沉積，其機(jī)制可能與通過(guò)升高血清脂聯(lián)素水平，進(jìn)而激活SIRT1/AMPK信號(hào)通路有關(guān)。

二甲雙胍；非酒精性脂肪肝??；脂聯(lián)素；SIRT1

0 引言

非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)在全球多個(gè)地區(qū)的發(fā)病率逐年增加，其在肥胖人群中的發(fā)病率為58%～74%[1]。NAFLD與肥胖、血脂升高、胰島素抵抗(Insulin resistance,IR)和隨之而來(lái)的糖耐量異常及2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)[2]密切相關(guān)。脂肪因子(瘦素、抵抗素)和炎性因子相互作用可導(dǎo)致IR，促進(jìn)脂肪肝炎性改變及肝臟糖脂代謝紊亂加重；而脂聯(lián)素(Adiponectin)是由脂肪組織分泌的唯一起保護(hù)作用的脂肪細(xì)胞因子，具有抗炎、抗糖尿病、抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。沉默調(diào)節(jié)蛋白1(SIRT1)是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的一種蛋白去乙?；福哂懈纳仆庵芤葝u素抵抗、促進(jìn)脂類(lèi)物質(zhì)被動(dòng)員的作用[3]。SIRT1可使脂肪細(xì)胞的叉頭轉(zhuǎn)錄因子O1(FOX1)發(fā)生去乙酰化，進(jìn)而上調(diào)脂聯(lián)素的轉(zhuǎn)錄水平[4]，但在NAFLD發(fā)病中的作用尚未完全明確。本研究利用高脂飲食喂養(yǎng)大鼠復(fù)制NAFLD模型[5]，觀察脂聯(lián)素、SIRT1在NAFLD發(fā)病機(jī)制中的作用及二甲雙胍干預(yù)對(duì)NAFLD的療效。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 健康清潔級(jí)5～6周齡雄性SD大鼠34只，體重185～200 g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，由上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院動(dòng)物飼養(yǎng)中心分籠喂養(yǎng)。正常對(duì)照組給予普通飼料(上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供)喂養(yǎng)，高脂飼料(78%基礎(chǔ)飼料+15%豬油+5%蔗糖+1.8%膽固醇+0.2%膽鹽)由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司定制生產(chǎn)。鹽酸二甲雙胍片(500 mg/片，購(gòu)于上海施貴寶制藥公司)。胰島素(FINS)、脂聯(lián)素、游離脂肪酸(FFA)及三酰甘油(TG)試劑盒均購(gòu)于上海鈺森生物科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit(TAKARA公司)，SYBR premix EX TaqTMII(TAKARA公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備及分組 所有SD大鼠先用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字法分為對(duì)照組(NC組，12只)和模型組(HF組，22只)。喂養(yǎng)8周后，兩組隨機(jī)抽取6只，進(jìn)行稱(chēng)重(體重及肝重，并計(jì)算肝指數(shù))及血脂、胰島素等生化指標(biāo)檢測(cè)，比較各組之間肝組織病理學(xué)變化，鑒定HF組NAFLD造模成功。將剩余模型組大鼠隨機(jī)分為二甲雙胍干預(yù)組(HF+M組，8只，高脂喂養(yǎng)+二甲雙胍500 mg/(kg·d)]，高脂組(HF1組，8只)及剩余對(duì)照組(NC1組6只)均給予等體積生理鹽水，連續(xù)灌胃8周。

1.2.2 標(biāo)本采集及檢測(cè) 連續(xù)灌胃8周后，取材前禁食12 h(不禁水)，稱(chēng)重，用乙醚腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，離心，分離血清存于超低溫冰箱備用；使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT、AST、TC、TG、FBG；分別按照脂聯(lián)素、胰島素ELISA試劑盒說(shuō)明要求測(cè)定大鼠血清脂聯(lián)素、FINS，根據(jù)FBG、FINS計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)IRI=(FINS×FBG)/22.5。迅速取出各樣本肝右葉，大小為2.5 cm×2.5 cm×0.5 cm，甲醛溶液固定，包埋，制備石蠟切片，行HE染色，做肝組織病理學(xué)觀察；其余肝臟-70 ℃凍存。

1.2.3 氯仿∶甲醇(2∶1)制備肝臟勻漿，應(yīng)用TG測(cè)定試劑盒檢測(cè)肝臟TG水平。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 取各樣本肝組織30 mg，TRIzol抽提大鼠肝臟總RNA，按SuperscriptⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。引物設(shè)計(jì)與合成：基因序列均從GenBank中獲取，引物由南京生工合成：adiponectin：5′-GTCTCCGTGCTTCCGATGAA-3′，5′-GGTCAAACTGGACTTGGGGT-3′；SIRT1：5′-GATGATGCTGACAGACCGGA-3′，5′-AGTTCCCAATGCTGGTGGAG-3′；AMPK-α:5′-GAGCCCTGAACTTGCTTTTACA-3′，5′-TGTCCGTTCTATGCGCTGG-3′；GAPDH：5′-CTCATGACCACAGTCCATGC-3′，5′-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3′。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)TRIzol方法提取大鼠肝臟總RNA，按SuperscriptⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。使用熒光定量PCR儀(羅氏96lightcycler)進(jìn)行目標(biāo)基因的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)。PCR檢測(cè)條件為:95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s,60 ℃ 45 s，40 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完成后，應(yīng)用反應(yīng)產(chǎn)物的溶解曲線檢測(cè)其均一性，每個(gè)反應(yīng)重復(fù) 3 次。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)所有樣品進(jìn)行規(guī)一化處理，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算樣本目的基因相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因。

2 結(jié)果

2.1 生化指標(biāo)等比較 二甲雙胍干預(yù)后，各組生化指標(biāo)、FFA測(cè)定及胰島素抵抗指數(shù)比較見(jiàn)表1。

2.2 肝組織病理HE染色 灌胃8周后，HF1組出現(xiàn)明顯脂肪變性，且胞漿呈大面積空泡化，被大量小泡性脂滴所占據(jù)，大部分細(xì)胞核被擠向細(xì)胞邊緣，肝竇不清晰，肝索排列紊亂，肝小葉內(nèi)及匯管區(qū)可見(jiàn)大量以單核、淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及點(diǎn)狀壞死;HF+M組肝小葉結(jié)構(gòu)仍有紊亂,肝細(xì)胞腫脹程度、胞漿疏松化較HF1組略有減輕，脂肪泡數(shù)目減少，脂滴縮小。見(jiàn)圖1。

表1 二甲雙胍對(duì)NAFLD大鼠生化指標(biāo)、FFA及脂聯(lián)素的影響

注：*與NC1組比較，P<0.05；#與HF1組比較，P<0.05

圖1 肝組織HE染色(×100)

2.3 各組肝臟Adiponectin、SIRT1 mRNA、AMPK-α mRNA表達(dá) 與NC1組比較，HF1組肝臟SIRT1、AMPK-α、adiponectin mRNA表達(dá)均降低；二甲雙胍干預(yù)后,肝臟SIRT1、AMPK-α mRNA表達(dá)增加(P<0.05)，而adiponectin mRNA表達(dá)無(wú)顯著變化(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 干預(yù)后各組大鼠肝臟Adiponectin、SIRT1 mRNA、AMPK-α mRNA表達(dá)比較

注：*與NC1組比較，P<0.05；#與HF1組比較，P<0.05

3 討論

NAFLD是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝臟損害。經(jīng)典N(xiāo)AFLD“二次打擊學(xué)說(shuō)”認(rèn)為，外周胰島素抵抗通過(guò)減弱胰島素抑制脂肪分解的作用，使大量游離脂肪酸從脂肪組織分解釋放而增加肝臟的脂肪酸攝入，導(dǎo)致TG在肝細(xì)胞內(nèi)過(guò)度合成，形成肝臟脂肪變性，即“第一次打擊”；各種炎癥因子、脂肪因子紊亂增加了細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激及線粒體功能障礙，可最終加重肝臟的炎癥及纖維化，即“第二次打擊”。由脂肪組織分泌的促炎和抗炎脂肪因子間的平衡失調(diào)有助于NAFLD 的發(fā)生、發(fā)展。脂聯(lián)素是由脂肪細(xì)胞特異性分泌，具有2種受體：AdipoRl和AdipoR2。AdipoRl分布廣泛，而AdipoR2主要表達(dá)于肝臟，具有改善外周組織胰島素抵抗、降低葡萄糖和促進(jìn)脂質(zhì)分解的功能[6]。

本研究顯示，在高脂飲食喂養(yǎng)8周后，模型組大鼠出現(xiàn)多飲、多尿、多食，體重及血糖升高，血清TC、TG及FFAs水平較對(duì)照組明顯升高，脂聯(lián)素水平下降。肝臟組織學(xué)顯示，混和組肝臟出現(xiàn)明顯的脂肪變性，胞漿空泡化，被大量小泡性脂滴所占據(jù)，證實(shí)高脂誘導(dǎo)NAFLD造模成功。作為糖尿病一線用藥，二甲雙胍具有降糖、降脂及改善胰島素抵抗的作用，同時(shí)，部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，其可以改善NAFLD肝臟脂肪形態(tài)學(xué)變化，根據(jù)NAFLD最新診療指南[7]，推薦二甲雙胍用于NAFLD的治療，但有關(guān)的機(jī)制尚不完全清楚。二甲雙胍可通過(guò)降低血漿葡萄糖水平而間接下調(diào)胰島素及胰島素生長(zhǎng)因子-1水平[8-10]，還可通過(guò)激活A(yù)MPK活性，阻止肝臟葡萄糖的釋放、促進(jìn)骨骼肌葡萄糖的攝取而改善胰島素抵抗[11-12]。此外，二甲雙胍通過(guò)抑制AMPK活性的相關(guān)基因(ACC1、ACC2和HMG-CoA[9,13-14]，而減少游離脂肪酸的脂質(zhì)合成，進(jìn)而改善胰島素抵抗。本研究中，模型組大鼠經(jīng)二甲雙胍灌胃后，血糖、血脂、肝酶指標(biāo)及胰島素、脂聯(lián)素水平均明顯改善，肝臟脂肪變程度部分逆轉(zhuǎn)，推測(cè)二甲雙胍可能通過(guò)提高脂聯(lián)素水平而部分改善肝臟IR。

SIRT 是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴(lài)的蛋白去乙?；?，通過(guò)使多種蛋白質(zhì)的賴(lài)氨酸殘基發(fā)生去乙酰化而發(fā)揮細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)(如能量代謝、糖脂代謝等)、改善氧化應(yīng)激及線粒體功能障礙和減輕炎癥反應(yīng)等發(fā)揮改善NAFLD肝臟病變的作用。應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)增加SIRT1表達(dá)，明顯提高大鼠血清脂聯(lián)素水平和肝組織AdipoR2的表達(dá)，減輕高脂飲食誘發(fā)的肝細(xì)胞脂肪變性[9]。脂聯(lián)素可增加肌管細(xì)胞和枯否細(xì)胞的SIRT1蛋白表達(dá)，基因敲除AdipoR1和AdipoR2可完全阻斷上述調(diào)節(jié)作用，提示脂聯(lián)素直接上游調(diào)節(jié)SIRT1。AMPK為“細(xì)胞能量調(diào)節(jié)器”，在培養(yǎng)的肝細(xì)胞和動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)SIRT1通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK的上游激酶-肝激酶B1直接磷酸化AMPK亞單位的172位蘇氨酸激活A(yù)MPK。

有研究顯示，在高熱量飲食誘導(dǎo)的大鼠NAFLD模型中，肝臟SIRT1的表達(dá)量顯著下降，而在飲食熱量限制后，肝臟的SIRT1表達(dá)量顯著升高，并且肝臟病變得到明顯改善[10-11]，而全身SIRT1敲除和肝臟特異性SIRT1敲除的小鼠則出現(xiàn)嚴(yán)重的肝臟脂肪變性，甚至炎癥反應(yīng)[13-16]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組SIRT1水平較對(duì)照組下降，二甲雙胍干預(yù)后，其水平可升高。推斷SIRT1可作為NAFLD病理生理過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，通過(guò)下游多種機(jī)制而發(fā)揮改善NAFLD肝臟病變的作用。在對(duì)高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)小鼠進(jìn)行肝SIRT1基因敲除后，小鼠則會(huì)出現(xiàn)明顯的肝脂肪變、炎癥改變及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)[17]，由此證實(shí)SIRT1具有胰島素抵抗、胰島素敏感性、改善氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)功能。

本研究采用RT-PCR發(fā)現(xiàn),模型組大鼠肝臟中AMPK-α、脂聯(lián)素、SIRT1 mRNA表達(dá)低于對(duì)照組，這可能是攝入高熱量抑制了SIRT1的表達(dá)，是機(jī)體的代償反應(yīng)。在使用二甲雙胍后，高脂組肝臟AMPK-α及SIRT1 mRNA表達(dá)水平較高脂組升高，脂聯(lián)素mRNA表達(dá)有增加趨勢(shì)。

綜上所述，高脂喂養(yǎng)大鼠可導(dǎo)致肝組織脂肪變，伴隨血清中脂聯(lián)素水平降低，肝組織SIRT1、adiponectin、AMPK-α mRNA表達(dá)下降及肝臟TG堆積。二甲雙胍可明顯升高血清脂聯(lián)素水平，可能通過(guò)調(diào)節(jié)肝臟Adip-SIRT1-AMPK信號(hào)通路導(dǎo)致脂質(zhì)合成的關(guān)鍵酶ACC和SREBP的表達(dá)下調(diào)，繼而改善脂質(zhì)沉積，這可能是防治NAFLD發(fā)生的重要機(jī)制之一，具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Effect of metformin on mRNA expression of adiponectin and SIRT1 in liver tissue of NAFLD rats

SHEN Tian,LEI Tao*,XU Bi-lin,CHEN Lin,ZHANG Zhi-jian

(Shanghai Putuo District Center Hospital,Shanghai 200062,China)

Objective To observe the effect of metformin on mRNA expression of liver adiponectin and SIRT1 in NAFLD rats induced by high-fat diet,and discuss the possible mechanisms.Methods Totally 34 SD rats were randomly divided into two groups:normal control group (NC group,n=12,normal diet) and high fat group (HF group,n=22,high fat diet).Six rats were randomly selected from two groups respectively after being fed for 8 weeks to confirm that the NAFLD model had been established.The other NAFLD rats in HF group were divided into metformin treatment group (HF+M group,n=8) and HF1 group (n=8).Rats in HF+M group and NC1 group were respectively given intragastric administration of metformin 500 mg/(kg·d) and equal volume of saline for 8 weeks.The levels of serum alanine transferase (ALT),aspartate aminotransferase (AST),total cholesterol (TC),total glyceride (TG) and free fatty acid (FFA) were detected after 8 weeks of gavage,the fasting serum glucose and insulin (FINS) level were measured and the insulin resistance index (HOMA-IR) were calculated.The liver pathological changes were observed by HE staining,and the adiponectin,SIRT1 and AMPK-α mRNA were measured by using real time PCR.Results After 8 weeks of high-fat diet,the NAFLD rat model of HF group which was complicated with insulin resistance was established.Compared with HF1 group,the levels of serum TC,TG,FFA,FBG,ALT and AST,the liver TG content and HOMA-IR in HF+M group were lower (P<0.05),while the level of adiponectin was higher (P<0.05),and the pathological changes of rats′ liver were improved.The expression of SIRT1,adiponectin and AMPK-α mRNA in the liver in HF+M group was higher than that of HF1 group (P>0.05).Conclusion Metformin can alleviate the insulin resistance and the liver TG deposition of NAFLD rats induced by high-fat diet,the mechanism may be associated with the activation of SIRT1/AMPK signal pathway through up-grading the serum adiponectin level.

Metformin;Nonachoholic fatty liver disease (NAFLD);Adiponectin;SIRT1

2016-05-22

上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院，上海 200062

上海市衛(wèi)生局青年科研項(xiàng)目(2013Y079)；上海市中醫(yī)藥大學(xué)后備業(yè)務(wù)專(zhuān)家培養(yǎng)計(jì)劃，上海市普陀區(qū)臨床重點(diǎn)專(zhuān)科-內(nèi)分泌科項(xiàng)目(2016PTZK05)

10.14053/j.cnki.ppcr.201612003

*通信作者