孫 燦，劉 凱，趙 晴，孔 娟*

·論著·

膽維丁乳對酵母多糖所致多器官功能障礙綜合征小鼠腎臟作用的研究

孫 燦1，劉 凱2，趙 晴1，孔 娟1*

目的 研究膽維丁乳對酵母多糖所致多器官功能障礙綜合征小鼠腎臟的作用。方法 選取C57 BL/6源性的野生小鼠36只，隨機分為對照組、膽維丁乳組、酵母多糖組、膽維丁乳+酵母多糖組，每組9只，室溫飼養(yǎng)，按組別分別自由飲水或添加膽維丁乳喂養(yǎng)14 d。2周后，酵母多糖組、膽維丁乳+酵母多糖組腹腔注射酵母多糖混懸液，對照組、膽維丁乳組腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液，18 h后處死各組小鼠，分別進行HE染色，觀察腎臟組織病變情況；Western blot技術(shù)檢測炎癥因子蛋白表達；用TRizol法按照試劑說明書提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；采用SPSS 16.0 進行統(tǒng)計學處理。結(jié)果 膽維丁乳+酵母多糖組小鼠炎癥因子IL-6、IL-18蛋白及mRNA的表達、尿素及肌酐水平高于酵母多糖組(P<0.05),且腎臟組織病理學改變較嚴重。結(jié)論 對于正常生長的小鼠，給予膽維丁乳不會加重小鼠的腎臟負擔；對于已經(jīng)發(fā)生急性腎損傷的小鼠，膽維丁乳的攝入會加重腎臟損傷。

膽維丁乳；酵母多糖；急性腎損傷

0 引言

多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)是當機體受到感染、休克、創(chuàng)傷、胰腺炎等多種打擊后發(fā)生的臨床綜合征，發(fā)病機制復(fù)雜，是ICU危重癥患者的主要死亡原因，MODS時急性腎損傷進展快，并影響預(yù)后。MODS是多種打擊誘發(fā)的臨床綜合征，加上治療因素干擾，其病理過程和臨床特征模擬十分困難[1-2]。因此，MODS動物模型的成功建立是MODS相關(guān)研究的關(guān)鍵[3-4]。

維生素D是脂溶性維生素家族中最為重要的成員，其調(diào)節(jié)鈣磷代謝、治療佝僂病的原理已為大家廣泛接受[5-7]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，維生素D具有更為廣泛的生理作用，其主要通過與廣泛分布于各組織、器官中的維生素D受體結(jié)合而發(fā)揮調(diào)節(jié)下位基因的作用，影響人體內(nèi)諸多系統(tǒng)的生理功能，另外，很多研究認為，維生素D參與人體內(nèi)免疫反應(yīng)的進程[8]。故有學者認為維生素D是一種激素。

近期的研究發(fā)現(xiàn)，維生素D與很多疾病，如炎癥性腸病、牙周炎、非酒精性脂肪性肝病、毛細支氣管炎、糖尿病、甲狀腺疾病密切相關(guān)，但與腎臟疾病關(guān)系的研究很少，尤其是維生素D與急性腎損傷關(guān)系的研究未見報道。本研究選用的膽維丁乳(Cholecalciterol cholesterol emulsion，CCE)，是一種臨床常用制劑，每支含有維生素D330萬U(8 mL)，是活性維生素D3的前體，同時選取酵母多糖致小鼠MODS模型為研究載體，研究膽維丁乳對MODS小鼠腎臟的作用。

1 實驗材料與方法

1.1 主要實驗試劑 膽維丁乳，酵母多糖，蛋白濃度測定試劑盒，Trizol，PMSF(蛋白酶抑制劑)電泳緩沖液，轉(zhuǎn)膜緩沖液，封閉液，一抗IL-6，IL-18，羊抗小鼠，羊抗兔，ECL化學發(fā)光試劑盒，異丙醇，氯仿，無水乙醇，High Capacity cDNA Reverse Transcription試劑盒，GoTag Green Master Mix試劑盒。

1.2 實驗動物分組及動物模型建立 實驗動物分組：選取C57 BL/6源性的野生小鼠36只，2月齡，體重20～25 g，雄性，隨機分為陰性對照組(C組)、膽維丁乳對照組(CCE組)、酵母多糖實驗組(Z組)、膽維丁乳+酵母多糖實驗組(CCE+Z組)，室溫飼養(yǎng)，飼料為普通動物飼料，按組別分別自由飲水或添加膽維丁乳喂養(yǎng)14 d(CCE組及CCE+Z組應(yīng)用膽維丁乳20 μL溶于200 mL純水避光喂養(yǎng))。

MODS動物模型制備：四組小鼠飼養(yǎng)2周后，將酵母多糖0.1 g與0.9%氯化鈉溶液2 mL配制成混懸液，Z組及CCE+Z組按500 mg/kg劑量予無菌腹腔注射酵母多糖混懸液，C組及CCE組予無菌腹腔注射等量的0.9%氯化鈉溶液。

1.3 組織學處理 Z組、CCE+Z組小鼠腹腔注射酵母多糖混懸液，C組、CCE組予無菌腹腔注射等量的0.9%氯化鈉溶液18 h后，脫頸處死各組小鼠，立即冰上取新鮮腎臟組織，應(yīng)用OCT復(fù)合物包埋，-80 ℃冰箱冷凍、切片，HE染色,200倍顯微鏡下觀察腎臟組織病變情況。

1.4 Western blot測定IL-6、IL-18的表達水平 用組織蛋白裂解液(美國Boston Bioproduct公司)提取腎臟組織蛋白；測定蛋白濃度(美國BioRad公司的蛋白質(zhì)定量試劑盒)；常規(guī)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉；4 ℃孵育一抗過夜；洗膜，室溫孵育二抗1 h；滴加ECL發(fā)光液發(fā)光。IL-6為兔多克隆抗體，由美國Santa Cruz公司提供。

1.5 實時定量PCR測定小鼠腎臟組織細胞因子mRNA的表達水平 提取小鼠腎臟組織后，按照試劑說明書用TRizol法提取總RNA并將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA(采用美國Invitrogen公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒)。使用Primer 3.0設(shè)計合成特異性引物。引物設(shè)計序列如下：

IL-6 P1：ATAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC

P2：CTGACCACAGTGAGGAATGTCCAC

IL-18 P1：ACATCCGAAGCAACAAGC

P2：CGAAGTGAGAAGGCAACA

β-actin P1：CACTGTGCCCATCTACGA

P2：GGTCTTTACGGATGTCAACG

1.6 血清尿素氮、肌酐測定 經(jīng)右心室取血，離心后取上清，檢測各組小鼠血清尿素氮、肌酐含量，采用Sigma公司試劑盒，貨號Catalog Number MAK055，依照說明操作。

2 實驗結(jié)果

2.1 各組小鼠活動情況、進食(水)量、尿量、體溫等指標比較 ①四組小鼠按組別分別自由飲水或添加膽維丁乳飼養(yǎng)14 d，活動情況、進食(水)量、尿量、體溫、呼吸頻率等指標無明顯差別。②Z組及CCE+Z組小鼠從無菌腹腔注射酵母多糖混懸液至處死間隔時間為18 h，期間每2小時觀察1次兩組小鼠的狀態(tài)。注射酵母多糖6 h后，Z組及CCE+Z組小鼠無死亡，但兩組小鼠均出現(xiàn)了不同程度的尿量減少、嗜睡、腹瀉、多動、煩躁等癥狀。12～18 h后，兩組小鼠出現(xiàn)死亡，Z組死亡率為44%，CCE+Z組死亡率為33%，小鼠均出現(xiàn)了無尿、身體蜷縮、拒食、拒水、呼吸困難、體溫下降等多器官功能衰竭的癥狀，且兩組無明顯差別。

2.2 攝入膽維丁乳后，各組小鼠腎臟形態(tài)學及組織學觀察比較 ①C組、CCE組：小鼠腎臟大小正常，顏色紅潤，無腫脹、出血，光鏡下可見腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常，無變性壞死，且兩組細胞形態(tài)比較無明顯差異(見圖1A、圖1B)。②Z組、CCE+Z組：小鼠腎臟均明顯腫大，伴充血、水腫，且CCE+Z組小鼠腎臟體積腫大更明顯，光鏡下兩組樣本均可見大量的中性粒細胞及單核細胞浸潤，腎小球體積增大，細胞數(shù)增多；CCE+Z組病變更為嚴重，可見毛細血管出血、壞死，毛細血管基底膜彌漫性增厚(見圖1C、圖1D)。

圖1 不同組別小鼠病理學改變比較(HE，200×)

2.3 各組小鼠腎臟功能的比較 各組小鼠尿素氮、肌酐比較見圖2。C組與CCE組尿素氮、肌酐水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；Z組2項指標高于C組、CCE組(P<0.05)；CCE+Z組2項指標高于其余3組(P<0.05)。

圖2 各組小鼠尿素氮、肌酐水平比較(n=5)

2.4 各組小鼠腎臟組織炎癥因子蛋白及mRNA水平表達比較 由圖3、圖4可見，C組、CCE組IL-6、IL-18的蛋白及mRNA表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；Z組蛋白及mRNA表達水平高于C組及CCE組，CCE+Z組高于其余3組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖3 各組小鼠腎臟組織中IL-6、IL-18比較(n=5)

圖4 各組小鼠IL-6 mRNA、IL-18 mRNA表達水平比較(n=5)

3 討論

目前研究表明，采用酵母多糖引發(fā)多器官功能障礙綜合征MODS動物模型能較好地模擬臨床MODS的病理生理過程，在MODS的相關(guān)研究中已廣泛應(yīng)用。在MODS動物模型急性腎損傷中，酵母多糖啟動巨噬細胞中炎癥信號是與小鼠體內(nèi)Toll 樣受體(TLR2/TLR6 異質(zhì)二聚體)結(jié)合后發(fā)生的，并進而觸發(fā)了轉(zhuǎn)錄因子蛋白NF-κB的活化[9-12]，從而導(dǎo)致促炎因子TNF-α、IL-18、IL-6、AKT1、P21、P38、N19、FL129 等的基因表達[13]。異質(zhì)二聚體受體激活NF-κB后，小鼠機體內(nèi)產(chǎn)生大量的炎癥反應(yīng)細胞，如T淋巴細胞及中性粒細胞，從而導(dǎo)致急性腎損傷。

IL-6是由成纖維細胞及活化后的T淋巴細胞產(chǎn)生的炎癥因子，能促使前體B細胞向產(chǎn)生抗體的細胞轉(zhuǎn)化；同時與集落刺激因子協(xié)調(diào)作用，增強NK細胞的裂解功能[14-16]，從而加重小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。IL-18是IL-1家族成員之一，可參與誘導(dǎo)合成γ干擾素等[17]。最重要的作用是可以刺激T淋巴細胞的增殖，參與細胞因子的生成等，與其他炎癥因子共同作用[18-21]。其在小鼠體內(nèi)主要由腎臟實質(zhì)細胞產(chǎn)生，存在于腎小球的系膜細胞、腎小管上皮細胞[22-25]。

動物研究表明，小鼠急性腎損傷時，IL-6、IL-18等炎癥因子在損傷發(fā)生6 h后明顯增高，12～18 h達到峰值[26]。本研究中，小鼠注射酵母多糖后逐漸出現(xiàn)急性中毒反應(yīng)，注射后12～18 h小鼠的死亡率最高。CCE+Z組的腎臟損傷程度較其他組嚴重，病理切片可見大量中性粒細胞及單核細胞浸潤，腎小球體積增大，細胞數(shù)增多，毛細血管壞死、出血，毛細血管基底膜彌漫性增厚；另外，CCE+Z組小鼠腎臟組織中IL-6、IL-18的蛋白、mRNA表達水平，以及尿素、肌酐水平均高于其余3組，提示該組小鼠腎臟損傷最嚴重；IL-6、IL-18是導(dǎo)致小鼠腎臟急性損傷的炎癥因子。而Z組各項指標均高于C組、CCE組，C組、CCE組指標無明顯差異。

由上述結(jié)果可知，對于正常生長的小鼠，給予膽維丁乳不會加重小鼠的腎臟負擔；但是對于已經(jīng)發(fā)生急性腎損傷的小鼠，攝入膽維丁乳會明顯加重腎臟損傷。這與既往研究中維生素D對肝臟等器官有保護作用，維生素D可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，減輕炎癥反應(yīng)的結(jié)論相悖。可能的原因如下：①膽維丁乳為活性維生素D的前體，要發(fā)揮其生物學活性，必須在肝臟和腎臟經(jīng)歷2次羥化過程，第2次羥化在腎內(nèi)進行，進而加重腎臟負擔；②膽維丁乳攝入會引起高鈣血癥等離子紊亂，增加腎臟負擔，引起腎衰，加重MODS。關(guān)于使用活性維生素D是否會出現(xiàn)同樣的結(jié)果，有待進一步研究。

本研究結(jié)果表明，在全身炎癥反應(yīng)時，膽維丁乳會加重腎臟損傷，提示對于急慢性腎臟疾病患者、腎臟功能發(fā)育不健全的嬰幼兒患者，使用膽維丁乳時須謹慎，以防加重腎損傷或損傷腎臟功能。

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Effect of cholecalciterol cholesterol emulsion on kidney of mice with zymosan-induced multiple organ dysfunction syndrome

SUN Can1，LIU Kai2，ZHAO Qing1，KONG Juan1*

(1.Department of Clinical Nutrition,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China;2.Department of Pediatrics,Liaohe Oilfield General Hospital,Panjin 124010,China)

Objective To study the effect of cholecalciterol cholesterol emulsion(CCE)on kidney of mice with zymosan-induced multiple organ dysfunction syndrome.Methods Thirty six C57 BL/6 source wild type mice were randomly divided into 4 groups:control group,CCE group,zymosan group and CCE+Zymosan group,9 mice in each group.All the mice were fed with normal animal food and water or water+CCE according to the different groups at room temperature.Mice in CCE+Zymosan group and Zymosan group were given intraperitoneal injection of zymosan(500 mg/kg)after 2 weeks,while the mice in control group and CCE group were given intraperitoneal injection of same amount of 0.9% sodium chloride solution.After 18 h,all the mice were put to death.The renal histopathological changes were observed by HE staining;the protein expression of inflammatory indicators was detected by Western blotting;the total RNA was extracted with TRizol according to the reagent instruction and reversely transcribed into cDNA;SPSS 16.0 statistical software was used.Results The protein and mRNA expression of IL-6 and IL-18 and levels of urea and creatinine in CCE+Zymosan group was higher than those of Zymosan group(P<0.05),and the renal histopathological changes were more serious.Conclusion CCE do not increase the burden on the kidneys of normal growth mice,but it can aggravate the renal damage of mice with acute kidney injury.

Cholecalciterol cholesterol emulsion;Zymosan;Acute renal injury

2016-06-30

1.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，沈陽 110004；2.遼河油田總醫(yī)院兒科一病區(qū)，遼寧 盤錦 124010

國家自然基金課題(30971401、81170065)

10.14053/j.cnki.ppcr.201612001

*通信作者