■張曉曉 王倩茹 張明珠 紀(jì) 元

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院，山東煙臺(tái) 264670）

魚粉是水產(chǎn)飼料中的主要蛋白源，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)飼料，富含多種必需氨基酸、必需脂肪酸、礦物質(zhì)、維生素等[1]，具有較高的可消化能和良好的適口性。在水產(chǎn)飼料中具有重要地位[2]。隨著我國(guó)漁業(yè)、畜牧業(yè)等產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，魚粉的需求量也大大增加。組胺，是魚粉中的游離氨基酸在組氨酸脫羧酶的作用下脫羧后產(chǎn)生的[3]，而組胺含量過高會(huì)對(duì)養(yǎng)殖對(duì)象產(chǎn)生危害，輕者引起過敏，重者則會(huì)危及生命[4-5]。魚粉的儲(chǔ)藏條件是影響魚粉變質(zhì)的決定性因素。因此探究魚粉在不同的溫濕度下產(chǎn)組胺的規(guī)律對(duì)魚粉的儲(chǔ)藏具有重要意義。本試驗(yàn)通過一系列的檢測(cè)數(shù)據(jù)得出組胺的產(chǎn)生規(guī)律，科學(xué)的檢驗(yàn)了魚粉的保質(zhì)期限，以期為魚粉在加工儲(chǔ)存中的組胺控制方面提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑儀器

1.1.1 原料

魚粉，購(gòu)自青島龍興飼料有限公司，生產(chǎn)日期為2015.05.11，保質(zhì)期18個(gè)月。

1.1.2 試劑

正戊醇、三氯乙酸溶液（100 g/l）、碳酸鈉溶液（50 g/l）、氫氧化鈉溶液（250 g/l）、鹽酸（1+11）、組胺標(biāo)準(zhǔn)使用液（200 μg/ml）、偶氮試劑（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

1.1.3 儀器

錐形瓶、分液漏斗、比色管、比色皿、溫濕度表、TU-1810紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、SPSS Statistics17.0數(shù)據(jù)分析軟件。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溫濕度的記錄

記錄每天中午12點(diǎn)和晚上8點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的溫濕度。計(jì)算每月平均溫濕度并繪制成組合折線圖。計(jì)算方法如下。

式中：Thi——12：00溫度；

Tli——20:00溫度；

Thl——12：00濕度；

Tll——20:00濕度。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

吸取1 ml鹽酸于10 ml比色管中，另取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml組胺標(biāo)準(zhǔn)使用液（200 μg/ml），加水至2 ml，各比色管再加入3 ml碳酸氫鈉溶液，3 ml偶氮試劑，放置10 min后（溶液變?yōu)榧t棕色），分別進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，確定最大吸光度的波長(zhǎng)。

吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml組胺標(biāo)準(zhǔn)使用液（200 μg/ml），分別置于10 ml比色管中，加水至1ml,再各加1 ml鹽酸、3 ml碳酸鈉溶液、3 ml偶氮試劑，加水至10 ml刻度，混勻，放置10 min，用零管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，制成終濃度0、40、80、120、160、200 μg/ml于 472 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 試樣測(cè)定

稱取2～5 g魚粉，置于具塞錐形瓶中，加入15～20 ml三氯乙酸溶液，60℃水浴加熱0.5 h，過濾后，吸取5.00 ml濾液，置于分液漏斗中，加入NaOH溶液使呈堿性。

加入7.5 ml正戊醇，振搖5 min；提取3次后，合并正戊醇于25 ml容量瓶中，并稀釋至25 ml。吸取5 ml正戊醇提取液于分液漏斗中，每次加7.5 ml鹽酸振搖提取3次，合并鹽酸提取液并稀釋至25 ml容量瓶中備用。

試樣中各加3 ml碳酸鈉溶液、3 ml偶氮試劑，加水至刻度，混勻，放置10 min，用零管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，于472 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算結(jié)果[6]。

1.2.4 感官評(píng)定

以色澤、氣味、質(zhì)感為評(píng)定指標(biāo)，每月進(jìn)行一次評(píng)定，一項(xiàng)出現(xiàn)異常即為變質(zhì)。

1.2.5 數(shù)據(jù)計(jì)算與分析

①組胺含量的計(jì)算方法：

式中：X——試樣中組胺的含量(mg/100 g)；

vt——加入三氯乙酸溶液的體積(ml)；

m1——試樣中組胺的質(zhì)量（根據(jù)吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算）(μg)；

m2——試樣質(zhì)量(g)。

②組胺含量與溫濕度的關(guān)系

用SPSS Statistics17.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)溫濕度進(jìn)行二元線性分析，確定溫度和濕度對(duì)組胺產(chǎn)生量的影響系數(shù)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)室溫濕度周年變化

實(shí)驗(yàn)室溫濕度記錄，如圖1。6到9月份的溫濕度相對(duì)較高，10到次年3月份的溫濕度較低。

圖1 實(shí)驗(yàn)室溫濕度記錄圖

2.2 組胺含量周年變化

①繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2。

圖2 紫外可見分光光法標(biāo)準(zhǔn)曲線

用分光光度計(jì)對(duì)組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的全波段進(jìn)行掃描發(fā)現(xiàn)在472 nm紫外吸收峰最高。在此波長(zhǎng)下，對(duì)不同濃度組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)組胺含量在0～200 μg/ml之間與吸光度呈線性相關(guān)，在此范圍內(nèi)制定標(biāo)準(zhǔn)工作曲線為y=0.011 6x+0.105 4，(R2=0.964 1)。

②魚粉中組胺的產(chǎn)生量，如圖3。組胺的總含量在不斷增加，到12月份試樣中的組胺含量達(dá)到131.217 mg/100 g。

③ 每月組胺增長(zhǎng)量，如圖4。5、6、7、9月份的增長(zhǎng)速度較快，7月份組胺增長(zhǎng)量最大，為17.95 mg/100 g，其他月份組胺量增長(zhǎng)相對(duì)較慢。

2.3 實(shí)驗(yàn)室條件下組胺含量與溫濕度的關(guān)系

用SPSS Statistics17.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行線性回歸分析和逐步分析。

圖3 試樣中組胺含量折線圖

圖4 試樣中每月組胺增長(zhǎng)量折線圖

通過線性回歸分析和逐步方法進(jìn)行分析，得到表1～表3，由表1～表3可知，在逐步分析中由于溫度對(duì)因變量組胺含量的作用較小，所以不被引入回歸方程分析，分析結(jié)果表明，濕度對(duì)組胺含量的影響具有顯著性。設(shè)X為濕度，Y為每月組胺產(chǎn)生量，根據(jù)表3可列出方程Y=-10.219+0.274X（P＜0.05），濕度與每月組胺產(chǎn)生量呈正相關(guān)，符合分析結(jié)果。

表1 模型匯總

表2 Anovab

表3 系數(shù)a

2.4 感官評(píng)定結(jié)果

試樣每月感官評(píng)定結(jié)果見表4。

表4 試樣每月感官評(píng)定結(jié)果

由表4知，試驗(yàn)飼料最早出現(xiàn)變質(zhì)的指標(biāo)是氣味，8月出現(xiàn)異味，9月份開始發(fā)黏，根據(jù)感官評(píng)定變質(zhì)的指標(biāo)[7]判定樣品于8月份變質(zhì)，保質(zhì)期為15個(gè)月。

3 討論

3.1 關(guān)于組胺含量測(cè)定的方法

用分光光度計(jì)對(duì)組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的全波段進(jìn)行掃描發(fā)現(xiàn)在472 nm處紫外吸收峰最高，不同于其他實(shí)驗(yàn)中的480 nm波長(zhǎng)[6]。在此波長(zhǎng)下，對(duì)不同濃度組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)組胺含量在0～200 μg/ml之間與吸光度呈線性相關(guān)。

3.2 實(shí)驗(yàn)室條件下組胺含量與溫濕度的關(guān)系

儲(chǔ)藏環(huán)境中由于溫濕度的變化，導(dǎo)致魚粉的水分、酸價(jià)等指標(biāo)發(fā)生物理化學(xué)變化，進(jìn)而為產(chǎn)組胺提供了良好的生長(zhǎng)繁殖條件，從而使組胺生成速度加快，組胺含量增多[8]。

從3月份到8月份儲(chǔ)存魚粉的溫濕度都呈升高趨勢(shì),8月份到12月份的溫濕度逐漸降低。結(jié)合溫濕度記錄圖和試驗(yàn)所測(cè)得樣品中組胺含量可知隨著溫度和濕度的升高，魚粉中組胺的含量在不斷增加，且7月份和8月份升高最快，到11、12月份組胺含量增加速度減慢。

圖1中5月和7月實(shí)驗(yàn)室的溫度相同，但濕度（7月份濕度為68%RH，5月份是57%RH）相差較大，其他相鄰月份的實(shí)驗(yàn)室溫度相差也都比濕度相差小，試驗(yàn)結(jié)果（表1、2、3）也說明在適宜溫度范圍內(nèi)濕度對(duì)組胺的產(chǎn)生影響作用更大，與軟件分析結(jié)果相符。Sevim Kose等[9]在魚粉中組胺含量變化規(guī)律的研究中指出，溫度在0、20、30℃和 35℃時(shí)，對(duì)組胺生成量沒有顯著性影響。與試驗(yàn)結(jié)果相符。

3.3 保質(zhì)期的判定

魚粉儲(chǔ)藏環(huán)境中的溫度及濕度變化，是影響組胺含量變化的最直接、最可觀的因素。魚粉組胺含量超過1 000 mg/kg時(shí)，即可引起過敏性食物中毒[10]。由圖3可知，8月份魚粉中的組胺含量為1 110.487 mg/kg，已經(jīng)不能再作為飼料投喂了[11]。在感官評(píng)定方面，由表4知，試驗(yàn)飼料最早出現(xiàn)變質(zhì)的指標(biāo)是氣味，8月份出現(xiàn)異味，9月份開始發(fā)粘，根據(jù)國(guó)標(biāo)魚粉感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)[11]，在氣味、顏色、質(zhì)感、有毒物質(zhì)含量等方面至少一項(xiàng)出現(xiàn)異常，即判定該魚粉已發(fā)生變質(zhì)，不能繼續(xù)作為飼料，與組胺含量測(cè)定結(jié)果相符[11]。試驗(yàn)魚粉生產(chǎn)日期為2015年5月，組胺超標(biāo)日期為2016年8月，保質(zhì)期為15個(gè)月。而包裝上標(biāo)明的保質(zhì)期為18個(gè)月，其原因可能與魚粉的包裝方式、魚粉種類、實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存環(huán)境、儲(chǔ)藏方式、光照等因素有關(guān)。

4 結(jié)論

在本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儲(chǔ)存條件下，溫度和濕度對(duì)魚粉中組胺的產(chǎn)生量具有直接影響，其中濕度的影響更大。經(jīng)過科學(xué)試驗(yàn)確定在實(shí)驗(yàn)室存儲(chǔ)條件下，魚粉的保質(zhì)期為15個(gè)月。因此，建議魚粉儲(chǔ)存在低溫干燥的環(huán)境中，且使用時(shí)間盡量不要超過產(chǎn)品的保質(zhì)期。