■楊佳蕾 張學雯 李術(shù)娜*

（1.西北農(nóng)林科技大學經(jīng)濟管理學院，陜西楊凌 712100；2.河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河北保定 071001)

我國的畜禽主要食用玉米-豆粕型日糧，這種飼料富含半纖維素。木聚糖是半纖維素的一種主要組成部分，占植物干重的35%，是自然界中第二豐富的物質(zhì)資源[1-3]。研究表明畜禽食用木聚糖后使消化道內(nèi)容物具有較強的黏性，導致畜禽消化道功能減弱，影響畜禽的生長性能與飼料利用率。動物自身分泌的酶不能將攝入的木聚糖完全消化，畜禽會出現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)利用率降低，生長性能下降等現(xiàn)象。

大量研究證實，飼糧中輔加相應酶制劑，能夠提高動物對飼料的利用率，進而提高動物生長性能。譚權(quán)等[4]在日糧中添加木聚糖酶，發(fā)現(xiàn)其可促進肉雞生長性能；李建民等[5]在日糧中添加混合飼用酶制劑，結(jié)果表明可促進肉兔生長性能；胡向東等[6]在飼糧中添加木聚糖酶，證實可促進生長豬生長性能；張仁祥等[7]在日糧中添加復合酶，證實可促進泰山肉兔增重。但此法成本較高，因此有學者[8-9]嘗試在日糧中直接添加益生菌、產(chǎn)酶菌的方式來促進動物的健康節(jié)糧養(yǎng)殖，這種方法對菌劑提出了更高的要求：菌株不僅具有明確的產(chǎn)酶能力，還要易于生產(chǎn)，最重要的是要耐受動物胃腸道的極端環(huán)境。目前已報道的木聚糖菌株中[10-11]，學者們多注重對酶活力與酶性質(zhì)的研究，缺少對耐受動物胃腸道能力、生產(chǎn)能力及安全性的考察。

本研究通過篩選耐受動物胃腸道環(huán)境的產(chǎn)木聚糖酶的芽孢桿菌，并對菌株進行菌種鑒定與安全性試驗，為飼用產(chǎn)酶菌劑的研制開發(fā)積累菌種資源，奠定科學基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌源樣品

用對角線法采集保定市南市區(qū)牛糞便以及長期堆放腐敗秸稈、樹葉的10～15 cm深處土壤，大約各取50～100 g保存在采樣袋中，分別編號并記錄采集地點和時間。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 菌株篩選培養(yǎng)基

NB培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5.0 g，加水至1 000 ml，pH值7.2～7.4。

NA培養(yǎng)基：為NB培養(yǎng)基加入2%的瓊脂。

產(chǎn)木聚糖酶富集培養(yǎng)基：玉米芯木聚糖10.0 g，氯化鈉5.0 g，蛋白胨3.0 g，硝酸銨2.0 g，磷酸氫二鉀 2.0 g，七水合硫酸鎂 0.2 g，蒸餾水 1 000 ml，pH值自然。

產(chǎn)木聚糖酶分離培養(yǎng)基：瓊脂20.0 g，玉米芯木聚糖10.0 g，硝酸鉀1.0 g，磷酸氫二鉀0.5 g，氯化鈉0.5 g，七水合硫酸鎂0.2 g，蒸餾水1 000 ml，pH值自然。

1.1.2.2 菌株生理生化試驗培養(yǎng)基

參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》配制。

1.1.3 試劑

菌種鑒定試劑：根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》配制，包括本尼迪克特氏試劑、格里斯氏試劑、Kovac's試劑、甲基紅試劑、V-P測定試劑等。

人工胃液、人工腸液參照Galindo A B方法配制[12]。

膽酸鹽溶液配制：在100 mlNB培養(yǎng)基中加入膽酸鹽，配成濃度分別為0.5%、0.3%、0.1%的溶液，115℃滅菌30 min。

1.1.4 試驗動物

試驗小鼠：購買60只健康小白鼠，體重為(20±2)g，購回后進行3 d預飼養(yǎng)，然后分組進行試驗。房間溫度為（20±1）℃，相對濕度為50%。

肉兔：河北農(nóng)業(yè)大學標本園養(yǎng)殖基地購買的60日齡肉兔60只，隨機分為6組，每組10只，不分公母。采用籠內(nèi)飼養(yǎng)。

肉兔飼料：河北省禽塔集團購買。

配方見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

1.1.5 試驗菌粉

由河北民得富生物科技有限公司進行液體發(fā)酵，噴霧干燥，制成菌粉，最終制得含生物量為1.5×1011cfu/g的試驗菌粉。

1.2 產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌的分離篩選

1.2.1 產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌的富集培養(yǎng)與分離

將菌源樣品5.00 g放入含100 ml無菌水的三角瓶中，充分搖勻使成菌懸液，置80℃水浴20 min。進行稀釋涂布，培養(yǎng)到長出菌落，挑取形態(tài)不同的單菌落編號保藏于NA培養(yǎng)基斜面上。

1.2.2 產(chǎn)木聚糖酶芽孢細菌的篩選

分別挑取初篩菌株點種在產(chǎn)木聚糖酶分離培養(yǎng)基平板上，然后37℃培養(yǎng)48 h，用1.0%剛果紅溶液覆蓋培養(yǎng)基平板表面30 min，培養(yǎng)基表面用飽和氯化鈉溶液沖洗，觀察是否存在透明圈，將產(chǎn)生透明圈的菌株進行菌種保藏，并編號。

將初篩菌株接種于NB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)12 h，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，同樣條件培養(yǎng)24 h，取發(fā)酵液10 000 r/min離心5 min，取上清液測定木聚糖酶活力，選用GB/T23874—2009飼料添加劑木聚糖酶活力方法測定。

1.3 菌株的種屬鑒定

1.3.1 形態(tài)觀察

從NA培養(yǎng)基斜面上挑取菌株于NB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)24 h，稀釋涂布，倒置培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)。挑取單菌落進行制片，革蘭氏染色后觀察單菌體形態(tài)。

1.3.2 生理生化試驗

參照《伯杰細菌鑒定手冊》第八版[13]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]，對細菌進行生理生化鑒定。

1.3.3 菌株DNA提取和16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹繪制

參考李云程等[15]方法進行菌株DNA提取和16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹繪制。

1.4 產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌菌株安全性、胃腸道環(huán)境耐受性試驗

菌株A-5種子液的制備：從活化好的菌株A-5斜面挑取少量菌苔于NB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h，在超凈臺中用無菌水稀釋成濃度為1.0×108cfu/ml的種子液。

菌株的安全性試驗：根據(jù)GB159193.3—2003窛氏（KORBOR）法對菌株A-5進行毒性、一般體征和臟器安全性檢測。試驗小鼠灌入劑量分別為0.5、1.0 g/kg和5.0 g/kg體重，連續(xù)喂養(yǎng)14 d。試驗開始后每天觀察小鼠精神狀態(tài)、是否有中毒癥狀、生長及排便狀況。在小鼠斷頸處死前12 h對小鼠進行禁食，然后稱量各組小鼠重量，并對臟器進行觀察和稱重。

菌株人工胃液耐受性：將接種量1%菌株A-5種子液接入到人工胃液中，搖床培養(yǎng)并進行活菌計數(shù)。

菌株耐膽酸鹽試驗：將菌株A-5種子液按1%的接種量接種至膽鹽濃度分別為0.5%、0.3%、0.1%的NB培養(yǎng)基于37℃、200 r/min培養(yǎng)24 h后，進行活菌計數(shù)。

菌株人工腸液耐受性：將接種量1%菌株A～5種子液按1%的接種量接入到人工腸液中，搖床培養(yǎng)并進行活菌計數(shù)。

1.5 產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌制劑的肉兔飼喂效果

1.5.1 肉兔的分組和飼養(yǎng)管理

試驗設(shè)計成6組。對照組：飼喂全價飼料。試驗1～5組在全價飼料的基礎(chǔ)上添加A-5菌劑：添加量分別為0.10%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%，即分別配制成活菌體生物量為1.500×108、3.750×108、7.500×108、1.125×109、1.500×109cfu/g的飼料。

飼喂：每天飼喂肉兔3次，保持水槽內(nèi)水量充足。預試期2 d，正試期28 d。

1.5.2 試兔生長性能測定

試驗前后對肉兔分別稱重，記錄給料量。計算肉兔平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）和料重比（F/G）。

平均日采食量[g/(d·只)]=(給料量-剩料量)/(天數(shù)·只數(shù))；

平均日增重[g/(d·只)]=(試驗后體重-試驗初體重)/(天數(shù)·只數(shù))；

料重比=采食量/增重。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對生長指標的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05，表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌的篩選

在篩到的芽孢桿菌中用剛果紅法進行初篩，得到有透明圈菌株的48株（見圖1）。篩到的菌株大多數(shù)符合細菌的菌株形態(tài)。

圖1 菌株剛果紅初篩照片

將在產(chǎn)木聚糖酶發(fā)酵培養(yǎng)基中酶活力較高的14株菌株重新編號(見表2)，其中菌株A-5酶活力最高，達到56.848 U/ml。

表2 木聚糖酶活力測定結(jié)果

2.2 菌株的種屬鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)觀察

圖2 菌株A-5的單菌落及菌體形態(tài)

由圖2可見，菌株A-5表面呈乳白色，光滑，邊緣呈鋸齒狀，菌體成桿狀，革蘭氏染色反應呈陽性，大小為5.1×0.9 μm。

2.2.2 菌株的生理生化試驗

參照《伯杰細菌鑒定手冊》第八版和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，對細菌進行了生理生化鑒定。主要進行蔗糖發(fā)酵、V-P試驗、甲基紅、乳糖發(fā)酵、明膠液化等20多項試驗。以Bacillus subtilis標準菌株36K（登陸號EF433406）作為對照，見表3。2.2.3 菌株的16S rDNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

表3 菌株A-5生理生化試驗結(jié)果

將菌株A-5的16S rDNA序列結(jié)果放在GenBank上進行序列比對，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖3）。

圖3 菌株A-5的系統(tǒng)發(fā)育樹

經(jīng)過序列比對，供試菌株A-5應屬于芽孢桿菌屬。另外，供試菌株A-5與Bacillus subtilis36K的標準菌株16S rDNA序列的同源相似性高達99.95%，因此鑒定此菌株為Bacillus subtilis。

2.3 產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌菌株安全性、胃腸道環(huán)境耐受性試驗

2.3.1 菌株安全性試驗

小鼠攝入含菌株A-5的菌粉后呼吸平穩(wěn)，沒有出現(xiàn)中毒癥狀，更無死亡現(xiàn)象，無異常表現(xiàn)，生長狀況良好。經(jīng)過稱重，對照組和空白組體重相近。

2.3.2 菌株人工胃液耐受性情況

菌株A-5在pH值為3.0的人工胃液中0、1、2 h后平均存活率分別為100%、95.66%、90.13%，在pH值為2.0的人工胃液中0、1、2 h后平均存活率分別為100%、97.58%、92.07%。

2.3.3 菌株耐膽酸鹽試驗情況

菌株A-5在濃度分別為0.1%、0.3%、0.5%膽鹽溶液中，平均存活率分別為91.75%、16.55%、5.00%。

2.3.4 菌株人工腸液耐受性情況

菌株A-5在人工腸液中0、1、2 h后平均存活率分別為100%、92.35%、88.45%。

2.4 產(chǎn)木聚糖酶芽孢制劑的肉兔飼喂效果（見表4）

由表4可知，各試驗組平均日增重較對照組都有提高，料重比較對照組均有降低，試驗1～5組日均增重較對照組分別提高 5.57%（P＜0.01）、7.92%（P＜0.01）、5.48%（P＜0.01）、4.74%（P＜0.05）和 2.48%（P＞0.05），料重比較對照組分別降低了5.23%（P＜0.01）、6.09%（P＜0.01）、4.38%（P＜0.05）、4.03%（P＜0.05）和2.01%（P＞0.05）。菌劑添加量太少，產(chǎn)酶量過低，不能充分酶解飼料中的木聚糖；菌劑添加量太多，會使動物胃本身腸道菌群失衡。所以菌劑添加量太少或太多都不能使試驗動物生長性能達到最佳。

表4 試兔生長性能變化統(tǒng)計

3 討論

由于微生物來源的木聚糖酶是目前工業(yè)生產(chǎn)中木聚糖酶的主要來源。而微生物來源的木聚糖酶其產(chǎn)生菌則以芽孢桿菌屬菌株為主。前人已有對木聚糖酶生產(chǎn)菌株的報道，如羅玲等[16]獲得一株木聚糖酶生產(chǎn)菌株LMZY為異硫鏈霉菌，酶活力達3.543 U/ml；戚永躍等[17]得到一株產(chǎn)木聚糖酶菌株50647，鑒定其屬于擬盤多毛孢屬，木聚糖酶的酶活峰值為49.3 U/ml；鐘敏等[18]分離到一株產(chǎn)木聚糖酶的霉菌菌株X-1，木聚糖酶酶活達724.63 U/ml等。本研究獲得了產(chǎn)木聚糖酶的野生菌株，酶活力較高。但是在飼料中直接添加木聚糖酶產(chǎn)酶菌劑的研究卻未見報道，此法較酶制劑法成本更低。

目前，越來越多的學者關(guān)注腸道微生物結(jié)構(gòu)與動物生長與健康的相關(guān)性的關(guān)系。本試驗結(jié)果表明，在肉兔日糧中添加比例為0.25%木聚糖酶產(chǎn)酶菌劑可以提高肉兔的平均日增重，促進肉兔生長。分析原因可能是隨著菌劑的添加，會改善試兔的腸道菌群構(gòu)成，同時，菌劑進入兔的腸道環(huán)境后定植并產(chǎn)酶，增加了腸道消化酶的活力，雙方面的共同作用，致使動物增加了對日糧的消化利用能力，最終達到促進動物生長的目的。

4 結(jié)論

本試驗篩選得到一株產(chǎn)木聚糖酶的野生菌株A-5，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌，其產(chǎn)酶活力為56.848 U/ml。在肉兔日糧中添加該菌劑對肉兔的生長性能有顯著促進作用，研究結(jié)果為肉兔飼料的合理利用、肉兔的高效養(yǎng)殖提供了新的思路。