周賢珍，陳偉英，劉博，果德安，3，周毅生

(1.廣東藥科大學 中藥學院，廣東 廣州 510006； 2.廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥科學院，廣東 廣州 510006； 3.中國科學院上海藥物研究所/上海中藥現(xiàn)代化研究中心，上海 201203)

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UPLC法測定蘇木中巴西蘇木素和原蘇木素B的含量

周賢珍1，陳偉英2，劉博2，果德安2，3，周毅生1

(1.廣東藥科大學 中藥學院，廣東 廣州 510006； 2.廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥科學院，廣東 廣州 510006； 3.中國科學院上海藥物研究所/上海中藥現(xiàn)代化研究中心，上海 201203)

目的 建立同時測定蘇木中巴西蘇木素和原蘇木素B的質(zhì)量分數(shù)的超高效液相(UPLC)法。方法 采用UPLC-PDA方法，色譜柱為ACQUICTY UPLC HSS T3 (2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，流動相為甲醇-質(zhì)量分數(shù)0.2%的冰醋酸水溶液，梯度洗脫，洗脫時間7.5 min，柱溫40 ℃，流量為0.3 mL/min，檢測波長為280 nm。進樣量為10 μL。結(jié)果 巴西蘇木素和原蘇木素B均達到基線分離，質(zhì)量濃度在0.195～200 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關系，R2均為0.999 8；平均回收率分別為103.89%、99.83%，RSD為1.26%、1.87%。結(jié)論 相比HPLC法，UPLC法明顯提高了同時檢測蘇木中巴西蘇木素和原蘇木素B質(zhì)量分數(shù)的分析速度，并且靈敏度更高，可為以后建立蘇木質(zhì)量檢測方法新標準提供參考。

超高效液相色譜法； 蘇木； 巴西蘇木素； 原蘇木素B； 含量測定

蘇木(SappanLignum)為豆科植物蘇木(CaesalpiniasappanL.)的干燥心材[1]，具有舒筋通絡、活血散結(jié)等功效[2]。巴西蘇木素和原蘇木素B是蘇木中2個重要的活性成分[3]。已有文獻報道，巴西蘇木素具有抗痤瘡、降血糖、血管舒張、保肝、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗菌、抗感染[4-6]等藥理活性，原蘇木素B也具有較好的抗菌和抗腫瘤活性[7-9]。

2010年版《中國藥典》[10]蘇木項下含量測定采用的是HPLC技術，運行時間長達50 min，耗時較長。而2015年版《中國藥典》[11]蘇木項下沒有含量測定相關說明，但在“高效液相色譜法”項下指出超高效液相色譜儀(UPLC)是適應小粒徑(約2 μm)填充劑的新型高效液相色譜儀，具有耐高壓、進樣量小、死體積低、靈敏度高的優(yōu)點，有利于檢測效率和檢測質(zhì)量的提高。國家藥典委員會及許多學者[12]都開始致力于UPLC技術的推廣。本文首次將UPLC技術應用于蘇木中有效成分的測定分析，建立一種簡單高效的方法同時測定蘇木中巴西蘇木素和原蘇木素B的質(zhì)量分數(shù)，為建立蘇木的質(zhì)量檢測方法新標準提供參考。

1 儀器與試藥

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜(美國Waters公司)；ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱 (美國Waters公司，2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；8510超聲波清洗器(美國Branson公司)；BT125D電子天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司)；P/N Hei-VAP precision ML/G3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph公司)；5418R冷凍式離心機(德國Eppendorf公司)。

蘇木(康美藥業(yè)股份有限公司，批號：141102861，由上海藥物研究所上海中藥現(xiàn)代化研究中心果德安教授鑒定為豆科植物蘇木CaesalpiniasappanL.的干燥心材)；巴西蘇木素對照品(成都普思生物科技有限公司，純度質(zhì)量分數(shù)>99.2%，批號：PS000105，采用1H-NMR、13C-NMR和質(zhì)譜法進行結(jié)構(gòu)確證，并用高效液相色譜法測試對照品純度)；原蘇木素B對照品(成都普思生物科技有限公司，純度質(zhì)量分數(shù)>98.8%，批號：PS001125，采用1H-NMR、13C-NMR和質(zhì)譜法進行結(jié)構(gòu)確證，并用高效液相色譜法測試對照品純度)；乙腈(色譜級，默克股份有限公司)；冰醋酸(分析純，天津富宇精細化工有限公司)；水為超純水(默克密理博有限公司，ELIX超純水系統(tǒng))。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性

色譜柱采用ACQUICTY UPLC HSS T3 (2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相為甲醇(A)-0.2%的冰醋酸水溶液(B)，進行梯度洗脫(0 min，5%A；0.5 min，20%A；3.4 min，28%A；7 min，29.5%A；7.5 min，5%A)；采用PDA檢測器，檢測波長為280 nm，流速為0.3 mL/min，進樣量為10 μL，柱溫為40 ℃，樣品室溫為4 ℃，空白試劑為超純水。對照品與樣品的色譜圖見圖1。可見，空白試劑無干擾，巴西蘇木素和原蘇木素B保留時間分別為4.43、5.12 min。

0.0080.0040.000AU0.0080.0040.0000.300.200.100.00AUAU01234567t/min1221ABC

A.空白對照； B.蘇木水提物凍干粉； C.巴西蘇木素對照品和原蘇木素B對照品混合液； 1.巴西蘇木素; 2.原蘇木素B。

圖1 蘇木對照品及水提物的UPLC色譜圖

Figure 1 UPLC chromatogram of reference and water extract of Sappan Lignum

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 稱取蘇木粗粉100 g，置于2 000 mL圓底燒瓶中，用800 mL超純水浸泡12 h。浸泡結(jié)束后，用電熱套加熱煮沸，采用索氏提取法，常壓回流提取3次，每次1 h，使液體均勻回流，將每次得到的提取液合并，采用旋轉(zhuǎn)蒸法儀將提取液濃縮至100 mL，參照文獻[14-15]中蘇木水提物處理方法，待濃縮液冷卻至室溫，置于-80 ℃冰箱中預凍，次日于凍干機中凍干。取少量凍干粉，精密稱定，以超純水為溶劑，嚴格按照1 mg干粉∶1 mL水的比例進行配制，制成1 000 μg/mL的樣品溶液，0.22 μm濾膜濾過，所得濾液即供試品溶液。以該供試品為母液，超純水為溶劑，稀釋20倍，得到質(zhì)量濃度為50 μg/mL的供試品溶液。

2.2.2 巴西蘇木素對照品溶液的制備 取巴西蘇木素對照品適量，精密稱定，以超純水為溶劑，嚴格按照1 mg對照品∶1 mL水的比例進行配制，制成質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL的樣品溶液，0.22 μm濾膜濾過，所得濾液即巴西蘇木素對照品溶液。以該溶液為母液，超純水為溶劑，稀釋250倍，得到質(zhì)量濃度為4 μg/mL的巴西蘇木素對照品溶液。

2.2.3 原蘇木素B對照品溶液的制備 取原蘇木素B對照品適量，精密稱定，以超純水為溶劑，嚴格按照1 mg對照品∶1 mL水的比例進行配制，制成質(zhì)量濃度1 000 μg/mL的樣品溶液，0.22 μm濾膜濾過，所得濾液即原蘇木素B對照品溶液。以該溶液為母液，超純水為溶劑，稀釋400倍，得到質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL的原蘇木素B對照品溶液。

2.3 線性關系的考察

分別取巴西蘇木素和原蘇木素B對照品溶液(質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL)，以超純水為溶劑，稀釋2.5倍，得到質(zhì)量濃度均為400 μg/mL的巴西蘇木素對照品溶液及原蘇木素B對照品溶液。再采用等倍稀釋的方法，稀釋制備成質(zhì)量濃度均分別為400、100、25、12.5、3.13、1.56、0.78、0.39 μg/mL的系列巴西蘇木素對照品溶液和原蘇木素B對照品溶液。將以上質(zhì)量濃度相同的2份對照品溶液進行等體積混合，最終得到質(zhì)量濃度分別為200、50、12.5、6.25、1.56、0.78、0.39、0.195 μg/mL的8份混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，并記錄相應的色譜峰面積，進樣量均為10 μL。以對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，色譜峰面積為縱坐標(Y)繪制標準曲線，進行線性回歸分析，得巴西蘇木素的線性回歸方程為Y巴西蘇木素=65.092X-6 500.7(R2=0.999 8)，原蘇木素B的線性回歸方程為Y原蘇木素B=31.167X-1 933.6(R2=0.999 8)，表明巴西蘇木素和原蘇木素B在0.195～200 μg/mL范圍內(nèi)，均與各自的峰面積有良好的線性關系。

2.4 精密度試驗

取同一份供試品溶液(質(zhì)量濃度為50 μg/mL)，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，重復進樣6次，每次進樣量均為10 μL，記錄相應的色譜峰面積，結(jié)果計算得巴西蘇木素和原蘇木素B的峰面積RSD值分別為0.46%、0.78%，表明方法精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取同一份供試品溶液(質(zhì)量濃度為50 μg/mL)，按“2.1”項下色譜條件，分別于0、3、6、12、24、36 h進樣，進樣量均為10 μL，記錄相應的色譜峰面積。結(jié)果計算得到巴西蘇木素和原蘇木素B的峰面積的RSD值分別為0.64%、1.73%，表明樣品中兩種成分巴西蘇木素和原蘇木素B在36 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復性試驗

取同一批蘇木藥材，按“2.2.1”項下方法制備蘇木凍干粉，分6次精密稱定凍干粉適量，配制成質(zhì)量濃度50 μg/mL的供試品溶液6份。按“2.1”項下色譜條件進樣分析，進樣量均為10 μL，記錄相應的色譜峰面積，計算巴西蘇木素和原蘇木素B的質(zhì)量分數(shù)分別為8.16%、5.67%，RSD值分別為3.18%、3.47%，表明方法重復性好。

2.7 回收率試驗

精密稱定已知質(zhì)量分數(shù)的蘇木水提液凍干粉6份，稀釋制備成質(zhì)量濃度為50 μg/mL的供試品溶液。取以上干粉溶液1 000 μL，分別加入1 000 μL巴西蘇木素對照品溶液(4 μg/mL)及1 000 μL原蘇木素B對照品溶液(2.5 μg/mL)，得到供試品與2種對照品混合溶液(以各溶液濃度與體積的乘積計算含量，即每份樣品中，凍干粉質(zhì)量為50 μg，巴西蘇木素質(zhì)量為4 μg，原蘇木素B質(zhì)量為2.5 μg)。按“2.1”項下色譜條件進樣分析，進樣量均為10 μL，記錄相應的色譜峰面積，計算回收率。結(jié)果得到巴西蘇木素的平均回收率為103.89%，RSD為1.26%，原蘇木素B的平均回收率為99.83%，RSD為1.87%，見表1，表明樣品處理方法可靠。

2.8 樣品的測定

取“2.2.1”項下的供試品溶液(質(zhì)量濃度50 μg/mL)，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄相應的色譜峰面積，以峰面積和標準曲線計算質(zhì)量分數(shù)。結(jié)果測得巴西蘇木素的質(zhì)量分數(shù)為8.16%，RSD為3.18%(n=6)，原蘇木素B的質(zhì)量分數(shù)為5.67%，RSD為3.47%(n=6)。從100 g蘇木粗粉中提取得到8.9 g蘇木凍干粉，通過換算可以得到巴西蘇木素和原蘇木素B在蘇木粗粉中的質(zhì)量分數(shù)分別為0.726%、0.505%。

表1 巴西蘇木素和原蘇木素B的加樣回收率試驗結(jié)果

Table 1 Recovery results of brazilin and protosappanin B (n=6)

成分樣品中的量/μg加入量/μg測得量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%巴西蘇4.224.08.32102.48103.891.26木素4.244.08.40103.893.954.08.19105.843.994.08.19104.943.974.08.11103.614.114.08.21102.62原蘇木2.892.55.42101.1399.831.87素B2.932.55.3898.062.712.55.23100.582.742.55.1897.712.802.55.2899.032.942.55.50102.49

3 討論

[13]的蘇木水提工藝并進行優(yōu)化，確定采用索氏提取法，8倍水量浸泡，提取3次，每次1 h的方法進行提取，以制得的蘇木水提液凍干粉計算提取率，結(jié)果為8.9%，比文獻[13](提取2次，每次4.5 h，提取率為6.8%)提高了工作效率及提取率。由于水分的凍干并不影響樣品中化學成分的含量，因此本文將水提液制成了凍干粉，既提高了樣品的穩(wěn)定性又方便保存，且配樣操作簡單，可以獲得特定濃度的供試品。本文結(jié)果中的巴西蘇木素和原蘇木素B在蘇木粗粉中的質(zhì)量分數(shù)均大于0.5%，符合2010年版《中國藥典》蘇木含量測定項下要求。

超高效液相色譜(UPLC)與高效液相色譜(HPLC)的基本分離原理是一致的，本文在文獻[14]的蘇木HPLC分離條件的基礎上，參照文獻[12,15]報道的HPLC和UPLC的轉(zhuǎn)換公式進行條件摸索，得到了蘇木的UPLC分離條件，獲得了色譜柱類型、洗脫梯度、進樣體積、流速等相關參數(shù)。應用此條件，巴西蘇木素和原蘇木素B在7.5 min內(nèi)即可分離，色譜峰分離度為3.45。由此可見，以HPLC方法為基礎開發(fā)UPLC方法已經(jīng)在理論上得到豐富并具有可行性，對已開發(fā)HPLC方法的中藥的質(zhì)量檢測方法升級具有指導意義。

本文建立的蘇木樣品UPLC檢測方法精密度高，穩(wěn)定性、重復性良好，并體現(xiàn)了UPLC在中藥分析上快速、高效、低污染的明顯優(yōu)勢，可為今后建立蘇木質(zhì)量檢測方法新標準提供參考。

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(責任編輯：陳翔)

Determination of brazilin and protosappanin B in Sappan Lignum by UPLC

ZHOU Xianzhen1，CHEN Weiying2，LIU Bo2，GUO De′an2，3， ZHOU Yisheng1

(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmacetuicalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.GuangdongProvincialAcademyofChineseMedicalSciences,The2ndAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China; 3.ChineseAcademyofSciences,ShanghaiInstituteofMateriaMedica,ShanghaiResearchCenterforModernizationofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China)

Objective To develop an UPLC method to determine brazilin and protosappanin B in aqueous extract ofSappanLignum. Method Brazilin and protosappanin B were analyzed by UPLC. An ACQUICTY UPLC HSS T3 (2.1 mm×100 mm,1.8 μm) column was used with the mobile phase of methanol-water (0.2% glacial acetic acid) in gradient elution mode and it cost 7.5 minutes throughout the general courses. The column temperature was 40 ℃ with a flow rate of 0.3 mL/min and the detective wavelength was 280 nm.Each sample was injected by 10 μL. Results The results showed that the peaks of brazilin and protosappanin B were separated commendably at the same time. The chromatographic peak areas also had good linearity in a beamy range of 0.195-200 μg/mL (R2=0.999 8). The average recoveries of brazilin and protosappanin B were 103.89% (RSD=1.26%) and 99.83% (RSD=1.87%),respectively. Conclusions Compared to HPLC,it apparently promoted efficiency by UPLC in analyzing brazilin and protosappanin B ofSappanLignumwith higher sensitivity,which could provide a reference for the establishment of new determination standards ofSappanLignum.

UPLC;SappanLignum; brazilin; protosappanin B; determination

2016-09-28

國家自然科學基金青年基金項目(81202398)；廣東省科技計劃項目(2013B010102006,2014A020221035,2015A020211025)；廣東省中醫(yī)藥科學院中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究專項項目(YN2014ZHR209,YN2015MS03)；國家中醫(yī)藥管理局臨床基地科研專項項目(JDZX2015207)

周賢珍(1991—)，女，2014級碩士研究生，Email:1159391257@qq.com；通信作者：果德安(1962—)，男，教授，博士生導師，從事中藥質(zhì)量控制及體內(nèi)代謝研究，021-50271516,021-50272789，Email:daguo@simm.ac.cn；周毅生(1957—)，男，教授，碩士生導師，從事藥物新劑型及新技術研究，020-39352168，Email: yishzhou@aliyun.com。

時間：2016-12-05 11:44

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161205.1144.001.html

R927.1

A

1006-8783(2016)06-0729-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016092803