張火旺，曾建忠，卓曉明

（1．廣東省河源市藥品檢驗所，廣東 河源 517000； 2．廣東省東源衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東 河源 517000；3．廣東醫(yī)學(xué)院，廣東 東莞 523808）

高效液相色譜法測定青果丸中沒食子酸含量

張火旺1，曾建忠2，卓曉明3

（1．廣東省河源市藥品檢驗所，廣東 河源 517000； 2．廣東省東源衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東 河源 517000；3．廣東醫(yī)學(xué)院，廣東 東莞 523808）

目的 建立測定青果丸中沒食子酸含量的高效液相色譜法。方法 色譜柱采用Inertsil C18柱（150 mm×4．6 mm，5 m），以甲醇－0．1%磷酸溶液（5∶95）為流動相，檢測波長為273 nm，流速為1．0 mL／min。結(jié)果 沒食子酸質(zhì)量濃度在10．536～36．876 g／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，平均回收率為99．95%，RSD為0．24%（n＝6）。結(jié)論 該方法簡便、靈敏、穩(wěn)定、準確，無其他成分干擾，可作為青果丸質(zhì)量控制的有效方法。

青果丸；沒食子酸；高效液相色譜法

青果丸由青果、金銀花、黃芩、北豆根、麥冬、玄參、白芍、桔梗8味中藥組方，具有清熱利咽、消腫止痛的功效，用于肺胃蘊熱所致的咽部紅腫、咽痛、失音聲啞口干舌燥、干咳少痰[1]?，F(xiàn)行標準[2]中，只有黃芩的含量測定。為確保制劑質(zhì)量，保證用藥安全有效，對該藥的質(zhì)量標準進行研究。選取青果和白芍中沒食子酸作為指標性成分進行含量測定研究，本試驗中采用高效液相色譜（HPLC）法建立了測定該制劑中沒食子酸含量的方法，簡單快速，分離度好，可用于該產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

LC－2010AHT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；UV－2450型紫外分光光度計；CP225D型電子天平；SB2200型超聲處理器。沒食子酸對照品（批號為110831－201204，供含量測定用）購自中國藥品生物制品檢定所，含量為 100%；青果丸（市售，批號為20100401，20100604，20100302）；甲 醇 為 色 譜 純（TEDIA），磷酸（廣州化學(xué)試劑廠，批號為20080701－1），水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱 Inertsil C18柱（150 mm×4．6 mm，5 μm）；流動相：甲醇－0．1%磷酸溶液（5∶95）；沒食子酸檢測波長：273 nm；流速：1．0 mL／min；進樣量：20 μL；峰面積以外標法定量[2]。

2．2 溶液制備

精密稱取沒食子酸對照品13．17 mg，置50 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解至刻度，作為沒食子酸對照品貯備液。取本丸劑適量，制成粉狀，精密稱定，研細（過3號篩），稱取適量（約0．3 g），精密稱定，置50 mL容量瓶中，加50%甲醇適量，密塞，超聲處理30 min，放冷，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用微孔濾膜（0．45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按質(zhì)量標準中處方比例同法制備不含青果、白芍的陰性樣品，依法制備陰性對照品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

干擾試驗：分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，見圖1。結(jié)果組分的出峰時間區(qū)域沒有干擾峰，表明處方中其他成分及輔料對樣品的測定無干擾。

線性關(guān)系考察：分別精密量取沒食子酸對照品貯備液2．0，3．0，4．0，5．0，6．0，7．0 mL，置50 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，配成沒食子酸對照品溶液，按擬訂色譜條件分別進樣20 μL，測定峰面積，以峰面積（A）為縱坐標、沒食子酸對照品質(zhì)量濃度（C）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程 A＝51 142 C＋34 585，r＝0．999 9（n＝6）。結(jié)果表明，沒食子酸質(zhì)量濃度在 10．536～36．876 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖1 高效液相色譜圖

精密度試驗：取同一對照品溶液重復(fù)進樣6次，每次20 μL，測定峰面積。結(jié)果的 RSD為0．08%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取同一批樣品，精密稱取6份，依法制備供試品溶液，按樣品測定方法平行進樣測定含量。結(jié)果的 RSD為 0．10%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，室溫放置，每隔2 h測定1次，連續(xù)測定6次。結(jié)果的 RSD為0．73%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗：精密稱取已知含量的樣品（批號為20100401，沒食子酸含量為 4．460 1 mg／g）適量，置50 mL容量瓶中，共6份，分別加入沒食子酸對照品貯備液（沒食子酸含量0．263 4 g／L）1，2，3 mL，按供試品溶液制備方法制備待測溶液。精密吸取溶液6份，各20 μL，注入液相色譜議，測定，計算沒食子酸的回收率。結(jié)果見表1。

表1 沒食子酸加樣回收試驗結(jié)果（n＝6）

2．4 樣品含量測定

取3批青果丸，依法制備供試品溶液，進樣20 μL，測定，記錄峰面積，按外標法計算含量。結(jié)果批號為200100401，20100604，20100302的樣品的沒食子酸含量分別為4．460 1，4．416 6，4．384 7 mg／g。根據(jù)此測定結(jié)果，暫定青果丸中沒食子酸含量定量限為4．0 mg／g。

3 討論

波長選擇：HPLC在選擇檢測波長時，取沒食子酸對照品適量，用50%甲醇為溶劑，經(jīng)紫外－可見分光光度計在200～400 nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沒食子酸在272．8 nm波長下有最大吸收，靈敏度高，故選擇273 nm作為檢測波長。

提取方法選擇：以甲醇、50%甲醇、60%甲醇、70%甲醇4種不同溶劑分別采用超聲提取，結(jié)果以50%甲醇超聲處理結(jié)果為佳。分別超聲處理樣品10，20，30，40 min，測得沒食子酸的含量最高為超聲 30 min和40 min，故認為在超聲30 min基本提取完全，選用50%甲醇超聲處理30 min為宜。

流動相選擇：沒食子酸屬有機酸，極性較大，選擇反相高效液相色譜法，以甲醇－0．1 mol／L磷酸（20∶80）、甲醇－0．1 mol／L磷酸（10∶90）為流動相，供試品溶液中沒食子酸分離效果不好。選用甲醇－0．1 mol／L磷酸（5∶95）為流動相，出峰時間約為13 min，峰形尖銳，理論板數(shù)達5 000以上，達到分離要求。

幾批次樣品含量相差較大，可能與原質(zhì)量標準中對這種成分無含量控制有關(guān)。本試驗結(jié)果表明，該方法操作簡便，回收率高，專屬性強，重復(fù)性好，是青果丸質(zhì)量控制的有效方法，有利于更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量。

[1]王秋靜，張蒙強．粉碎度對青果水浸出物的影響[J]．中國藥業(yè)，1998，7（1）：24．

[2]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典（一部）[M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：797，附錄33．

[3]張建民，關(guān) 晶，徐蕭槿．高效液相色譜法測定利水通淋軟膠囊中沒食子酸含量[J]．中國藥業(yè)，2009，18（21）：37－38．

[4]黃花紅．反相高效液相色譜法測定血安膠囊中沒食子酸含量[J]．中國藥業(yè)，2015，24（7）57－58．

[5]何依玲，李曉譽．高效液相色譜法測定鐵莧菜中沒食子酸含量[J]．中國藥業(yè)，2007，16（11）：18．

[6]劉 源，沈好文．高效液相色譜法測定化痔靈片中沒食子酸含量[J]．中國藥業(yè)，2013，22（8）：56－57．

[7]包箐箐，向 錚，林崇良．高效液相色譜法測定溫州早茶中兒茶素含量[J]．中國藥業(yè)，2011，20（22）：50－51．

[8]張海鳳，董亞琳，張 琰．沒食子酸 －葡萄糖苷酶的抑制作用及其降糖機制研究[J]．中國藥業(yè)，2011，20（21）：192－195．

[9]孫桂梅，吳宏巖，王會平，等．高效液相色譜法測定克銀丸中沒食子酸含量[J]．中國藥業(yè)，2006，15（13）：42．

[10]龍海燕，彭飛城，姚 蓉．高效液相色譜法測定復(fù)方青果顆粒中沒食子酸含量[J]．中南藥學(xué)，2010，8（6）：416－419．

Content Determination of Chlorogenic Acid in Qingguo Pills by HPLC

Zhang Huowang1，Zeng Jianzhong2，Zhuo Xiaoming3
（1．Heyuan Institute for Drug Control，Heyuan，Guangdong，China 517000； 2．Dongyuan Health Vocational Technical School，Heyuan，Guangdong，China 517000； 3．Guangdong Pharmacy University，Dongguan，Guangdong，China 523808）

Objective To establish an HPLC method for the content determination of gallic acid in Qingguo Pills．Methods The HPLC method was adopted and the Inertsil C18column（150 mm×4．6 mm，5 μm）was used．The mobile phase was methanol－0．1%phosphoric acid（5∶95）．The detection wavelength was at 273 nm and the flow rate was 1．0 mL／min．Results The linear range of gallic acid was 10．536－36．876 μg／mL．The average recovery rate was 99．95%，RSD was 0．24%（n＝6）．Conclusion The method is simple，sensitive，stable and accurate，which can be used for the quality control of Qingguo Pills．

Qingguo Pills；gallic acid；HPLC

R284．1；R286．0

A

1006－4931(2016)02－0064－02

張火旺（1974－），男，廣東河源人，副主任藥師，研究方向為藥品檢驗及質(zhì)量標準，（電話）0762－3220319（電子信箱）zhw1011＠163．com。

2015－01－27；

2015－08－08)