張 競(jìng)，王艷偉

（河南省食品藥品檢驗(yàn)所，河南 鄭州 450003）

六味地黃膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究

張 競(jìng)，王艷偉

（河南省食品藥品檢驗(yàn)所，河南 鄭州 450003）

目的 建立測(cè)定山茱萸中馬錢苷含量的高效液相色譜（HPLC）法，修訂并提高六味地黃膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，增加熟地黃的薄層色譜鑒別方法。方法 色譜柱為 Agilent Zorbax SB－C18柱（250 mm×4．6 mm，5 m），流動(dòng)相為乙腈－0．05%磷酸溶液（9∶91），流速為1．0 mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)為236 nm。結(jié)果 薄層色譜斑點(diǎn)清晰，陰性無(wú)干擾，馬錢苷進(jìn)樣量在0．099～1．324 g范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r＝0．999 9），平均回收率為99．13%，RSD為1．43%（n＝6）。結(jié)論 該法操作簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)，能更好地控制六味地黃膠囊的質(zhì)量。

六味地黃膠囊；薄層色譜鑒別；馬錢苷；高效液相色譜法

六味地黃膠囊收載于 2010年版《中國(guó)藥典（一部）》，由熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉組方，用于腎陰虧損、頭暈耳鳴、腰膝酸軟、骨蒸潮熱、盜汗遺精、消渴，療效確切，是滋陰補(bǔ)腎的代表方劑[1]。臣藥酒萸肉中含有熊果酸、馬錢苷、齊墩果酸等有效成分，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用薄層掃描法來(lái)測(cè)定酒萸肉中熊果酸的含量，專屬性不強(qiáng)?，F(xiàn)代研究證明，熊果酸并不是真正的活性成分，而馬錢苷能顯著增強(qiáng)機(jī)體免疫、抗炎、抗休克的作用，是酒萸肉的主要活性成分[2－3]。為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，本試驗(yàn)中參考文獻(xiàn)[4－11]建立了測(cè)定六味地黃膠囊中馬錢苷含量的高效液相色譜法，并增加了熟地黃的薄層色譜鑒別，為六味地黃膠囊的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

Waters 2695型高效液相色譜儀－Waters 2998二極管陣列檢測(cè)器；AX205DR型電子天平（瑞士Mettler公司）。六味地黃膠囊（不同生產(chǎn)企業(yè)提供，共14批次）；馬錢苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為111640－200503）；熟地黃對(duì)照藥材（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為121196－200502）；甲醇、乙腈為色譜純（Merck公司），水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 薄層色譜鑒別(熟地黃)

取本品內(nèi)容物3 g，加水50 mL，溫?zé)崾钩浞秩苌?，加熱至沸，放冷，離心，取上清液，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取熟地黃對(duì)照藥材4 g，加水60 mL，煎煮30 min，放冷，用脫脂棉濾過(guò)，濾液用乙酸乙酯振搖提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。按處方和制備工藝制備缺熟地黃的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。取上述3種溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以二甲苯－乙酸乙酯（1∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以2，4－二硝基苯肼乙醇試液。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。耐用性試驗(yàn)考察了高濕度與低濕度（RH 75%，RH 25%）、室溫與低溫（RT 20℃，RT 18℃，RT 7℃）、不同廠家薄層色譜板（青島海洋化工廠分廠、煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所）對(duì)薄層色譜峰的影響。結(jié)果表明，色譜分離基本無(wú)影響，方法可行。

圖1 薄層色譜圖

2．2 酒萸肉中馬錢苷含量測(cè)定

2．2．1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent Zorbax SB－C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm），以乙腈－0．05%磷酸溶液（9∶91）為流動(dòng)相；流速：1．0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：236 nm；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按馬錢苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。

2．2．2 溶液制備

取馬錢苷對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含20 μg的溶液，即得對(duì)照品溶液；取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物，研細(xì)，混勻，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按照處方比例制備缺山茱萸的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2．2．3 方法學(xué)考察

陰性對(duì)照試驗(yàn)：分別取2．2．2項(xiàng)下3種溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果在與對(duì)照品溶液色譜峰相應(yīng)位置上，供試品溶液具有相同保留時(shí)間的色譜峰，馬錢苷和相鄰雜質(zhì)峰分離良好，陰性對(duì)照品溶液無(wú)干擾，色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密稱取馬錢苷對(duì)照品適量，加50%甲醇制成每1 mL含33．1 μg的對(duì)照品溶液，精密吸取3，5，10，15，20，30，40 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積，以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)、馬錢苷峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝2 E＋06 X－86 077，r＝0．999 9(n＝6)。結(jié)果表明，馬錢苷進(jìn)樣量在0．099～1．324 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2．2．2項(xiàng)下方法制備的對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定。結(jié)果馬錢苷峰面積的 RSD為0．61%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液（批號(hào)為100401），分別于0，2，4，6，8，10，12 h時(shí)各進(jìn)樣10 μL。結(jié)果馬錢苷峰面積的 RSD為0．56%（n＝7），表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（批號(hào)為100401）1 g，共6份，精密稱定，按2．2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定馬錢苷的含量。結(jié)果馬錢苷含量平均值為 2．004 7 mg／g，RSD為 1．29%(n＝6)，表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知馬錢苷含量的樣品（批號(hào)為100401）約0．5g共6份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入不同量的馬錢苷對(duì)照品溶液（0．997 g／L）0．5，1．0，1．5 mL 3個(gè)濃度各2份，按擬訂方法制備供試品溶液，測(cè)定馬錢苷的含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 馬錢苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2．2．4 樣品含量測(cè)定

取不同生產(chǎn)企業(yè)的樣品共14批，按2．2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg／g）

3 討論

檢測(cè)波長(zhǎng)選擇：本試驗(yàn)中采用二極管陣列紫外檢測(cè)器，于200～400 nm波長(zhǎng)范圍紫外光譜掃描顯示，馬錢苷在236 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，因此選擇236 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

提取方式和溶劑選擇：分別考察了50%甲醇加熱回流和超聲提取，結(jié)果表明，回流提取含量比超聲提取較高，故選擇回流提取。分別考察了甲醇和50%甲醇作為提取溶劑，結(jié)果表明，50%甲醇提取含量比甲醇提取較高，故選擇50%甲醇提取。提取溶劑用量分別考察了50 mL和25 mL，50 mL比25 mL提取含量較高，故選擇50%甲醇50 mL回流提取。

耐用性試驗(yàn)：考察了3根不同商品規(guī)格的色譜柱，如Agilent Zorbax SB－C18柱、Phenomenex Luna 5u C18柱和Wondasil C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm），測(cè)定同一批樣品，結(jié)果3種色譜柱測(cè)定結(jié)果重復(fù)性較好。

柱溫試驗(yàn)：分別考察了柱溫為25℃和40℃時(shí)進(jìn)樣測(cè)定馬錢苷的含量，兩者基本無(wú)差異。說(shuō)明不同柱溫測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性較好。

本試驗(yàn)所測(cè)定的14批樣品馬錢苷含量存在較大差異，這與原料藥材山茱萸中的馬錢苷含量高低有關(guān)。因此，為了更好地控制六味地黃膠囊的質(zhì)量，有必要加強(qiáng)原料藥材山茱萸和制劑中馬錢苷含量的檢測(cè)。

綜上所述，本試驗(yàn)中建立的方法操作簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)，精密度、重復(fù)性、回收率均滿足要求，可作為六味地黃膠囊的質(zhì)量控制方法。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M]．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：600－601．

[2]劉軼華，朱紅麗．山茱萸的現(xiàn)代藥理研究及應(yīng)用[J]．中國(guó)醫(yī)藥指南，2012，10（31）：601－602．

[3]水彩紅，曹 紅．HPLC法測(cè)定山茱萸藥材及六味地黃膠囊中馬錢苷的含量[J]．中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2005，6（4）：17－20．

[4]吳俊賢，陳楷斌，趙琦君，等．高效液相色譜法測(cè)定氣陰養(yǎng)骨片中馬錢苷含量[J]．中國(guó)藥業(yè)，2011，20（9）：24－25．

[5]楊 鋒，李 茜，費(fèi) 嘉，等．對(duì)《中國(guó)藥典》2010版一部六味地黃膠囊的商榷[J]．解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2012，28（6）：569－570．

[6]張翠英，李忠保，李振國(guó)，等．HPLC測(cè)定六味地黃顆粒中馬錢苷和丹皮酚含量[J]．中成藥，2008，30（12）：1 791－1 794．

[7]張曉堅(jiān)，康 建．六味地黃丸（濃縮丸）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J]．中國(guó)藥房，2009，20（27）：2 133－2 135．

[8]閻東海．HPLC測(cè)定濃縮六味地黃丸中馬錢苷含量[J]．中國(guó)現(xiàn)代中藥，2007，9（7）：18－19，23．

[9]林 靜，樂(lè)卿清，謝榮偉．高效液相色譜法測(cè)定六味地黃丸（濃縮丸）中馬錢苷的含量[J]．海峽藥學(xué)，2010，22（6）：91－92．

[10]姜建萍，曹 音，李建芳．六味地黃丸含量測(cè)定方法研究進(jìn)展[J]．中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，16（6）：136－138．

[11]王 聰．RP－HPLC測(cè)定六味地黃丸中馬錢苷的含量[J]．中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2015，13（2）：146－147．

Research on Improving the Quality of Liuweidihuang Capsules

Zhang Jing，Wang Yanwei
（Henan Provincial Institute for Food and Drug Control，Zhengzhou，Henan，China 450003）

Objective To establish an HPLC method for the content determination of loganin in Fructus Corni，and to modify and improve the quality standard for Liuweidihuang Capsules，to add the TLC method ofRadix Renntanniae．Methods Agilent Zorbax SB－C18column（250 mm×4．6 mm，5 μm） was used with the mobile phase consisted of acetonitrile－0．05% phosphoric acid（9∶91），at the flow rate of 1．0 mL／min，the detection wavelength was 236 nm．Results The TLC spots were clear and there were no interferences on the negative controls．The liner range of loganin was 0．099－1．324 μg（r＝0．999 9）．The average recovery was 99．13%，RSD was 1．43%（n＝6）．Conclusion This method is simple，specialty and suitable to control the quality of Liuweidihuang Capsules．

Liuweidihuang Capsules；TLC；loganin；HPLC

張競(jìng)，大學(xué)本科，研究方向?yàn)樗幬锓治?，（電子信箱）zjing780624＠163．com。

2015－06－17；

2015－08－05)

R284．1；R286．0

A

1006－4931(2016)02－0061－03