鄒紅梅, 左舜宇，黃東仁，牛曰華，康建平，張?zhí)炻?/p>

(福建省海洋環(huán)境與漁業(yè)資源監(jiān)測中心，福建 福州 350003)

高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定水產品中雄激素和糖皮質激素殘留

鄒紅梅, 左舜宇，黃東仁，牛曰華，康建平，張?zhí)炻?

(福建省海洋環(huán)境與漁業(yè)資源監(jiān)測中心，福建 福州 350003)

建立了同時測定水產品中雄激素和糖皮質激素殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質譜法，樣品用乙酸乙酯提取，經凈化、濃縮和定容后，以水、乙腈為流動相，用Kinetex -C18色譜柱 (2.1 mm×100 mm, 2.6 μm)分離，采用ESI源、多反應監(jiān)測模式進行測定。方法的定量限為0.728～2.140 μg/kg。在10～100 μg/kg加標水平范圍內，回收率為75%～115%，相對標準偏差為1.49%～9.92%。該方法操作簡便、靈敏度較高，可用于水產品中雄激素和糖皮質激素殘留的定量檢測。 [中國漁業(yè)質量與標準，2016,6(2):45-50]

液相色譜-串聯(lián)質譜法；雄激素；糖皮質激素；水產品；殘留

隨著水產養(yǎng)殖業(yè)的飛速發(fā)展，水產品在人們生活中所占比例越來越大，激素化合物由于能提高飼料轉化率并促進動物生長而被用于水產養(yǎng)殖[1-3]，然而殘留在水產品中的激素對人體健康具有潛在的致癌性等危害[3]，同時這些激素在體內可以通過不同的酶相互轉化，作用到人體各個神經和組織，然后通過調節(jié)各種組織細胞的代謝活動來影響人體的生理活動[4]。雄激素和糖皮質激素為最主要的兩大類激素，其中雄激素是一類含有環(huán)戊烷多氫菲基本骨架的化合物[1]，在養(yǎng)殖業(yè)中用于促進動物生長、提高蛋白轉化率。研究表明，雄激素間接被人攝入后，會干擾人體內自然激素的平衡，因此中國、歐盟明確規(guī)定在飼料中禁止使用雄激素藥物[5]。糖皮質激素為類固醇類化合物[3]，具有很好的抗炎作用，但長期食用會破壞機體的防衛(wèi)系統(tǒng)和抑制免疫反應能力，并可直接危及人的生命，中國規(guī)定了糖皮質激素化合物在動物性源性食品中的最大殘留量[6]。

目前，雄激素和糖皮質激素殘留常用的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法[7]、液相色譜法[8-9]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[10-11]和液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)[12-16]。其中，酶聯(lián)免疫法容易出現交叉反應及假陽性；液相色譜法抗干擾能力差，且靈敏度不能滿足檢測要求；GC-MS法具有高靈敏度和選擇性，但通常需要進行耗時長的衍生化處理才能進行測定；LC-MS/MS法所涉及的檢測樣品主要是牛肉[12]、雞肉[16]、血清[15]、廢水[14]，而且檢測激素種類少，只有對雄激素或糖皮質激素某一類激素的檢測，沒有雄激素和糖皮質激素同時檢測方法的研究。因此，綜合考慮靈敏度、穩(wěn)定性、工作效率等各種因素，選用LC-MS/MS作為本實驗的首選檢測方法，建立了同時測定水產品中雄激素和糖皮質激素殘留的新方法，該方法靈敏度高、穩(wěn)定性好，且前處理簡單，同時也為其他動物源性食品中的獸藥多殘留分析提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜儀Agilent 1200-Agilent 6410，配備電噴霧離子源(ESI源)；3-30K高速離心機(德國Sigma公司)；LR4000旋轉蒸發(fā)儀(德國Heidolph公司)；超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；MS5渦旋混合器(德國IKA公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)等。

標準品：睪酮( Testosterone, TS )，CAS號58-22-0；甲基睪酮( Methoxytestosterone，MTS)，CAS號58-18-4；諾龍(Nandrolone，NT)，CAS號434-22-0；地塞米松(Dexamethasone，DX)，CAS號50-02-2；醋酸地塞米松(Dexamethasone acetate，DXA)，CAS號1177-87-3；醋酸可的松( Cortisone acetate，CSA)，CAS號50-04-4；醋酸潑尼松(Prednisone acetate，PA-45)，CAS號125-10-0；醋酸潑尼松龍(Prednisolone acetate，PA-46)，CAS號52-21-1；睪酮-D3(Testosterone-D3，TS-D3)，CAS號77546-39-5；甲基睪酮-D3( Methoxytestosterone，MTS-D3)，CAS號58-18-4；純度均大于98.0%，購于德國Dr．Ehrenstorfer公司。

甲醇、乙酸乙酯、乙腈(色譜純，美國Merck 公司)；凈化劑(500 mg中性氧化鋁+200 mg PSA)(上海安譜公司)；無水硫酸鈉(分析純，國藥集團)，650 ℃灼燒4 h后儲存于干燥器中備用；實驗用水為超純水。

1.2 標準溶液的配制

分別準確稱取10.0 mg的標準物質，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成1 000 μg/mL標準儲備液，-18 ℃冰箱保存，用甲醇逐級稀釋成10.0和1.0 μg/mL的混合標準中間液；分別準確稱取5.0 mg的標準物質內標化合物，用甲醇溶解并定容至50 mL，配制成100 μg/mL的標準儲備液，-18 ℃冰箱保存，用甲醇逐級稀釋成1.0 μg/mL的混合內標使用液。

1.3 儀器條件

色譜條件：色譜柱為Kinetex-C18(2.1 mm×100 mm, 2.6 μm，美國Phenomenex公司)；流動相A為超純水，流動相B為乙腈，流速0.3 mL/min，梯度洗脫程序見表1，進樣量5 μL；柱溫40 ℃。

表1 流動相梯度洗脫程序
Tab.1 Gradient elution programs of mobile phase

質譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正離子摸式，多反應監(jiān)測(MRM)；霧化氣溫度350 ℃；霧化氣流速10.0 L/min；霧化氣壓力45.0 psi；雄激素和糖皮質激素優(yōu)化后的質譜參數及其保留時間見表2。

表2 雄激素和糖皮質激素化合物的HPLC-MS/MS儀器參數
Tab.2 HPLC-MS/MS parameters for androgens and glucocorticoids

1.4 樣品前處理

水產品取可食部分，充分勻漿，稱取5.0 g樣品(精確至0.01 g)，加入0.1 mL 1.0 μg/mL內標和15 mL乙酸乙酯，渦漩混勻1 min，超聲提取10 min，5 000 r/min離心5 min。殘渣用15 mL乙酸乙酯重復提取一次，合并上清液。加入凈化劑(500 mg中性氧化鋁+200 mg PSA)振蕩，渦漩混勻1 min，10 000 r/min離心5 min。上清液過無水硫酸鈉，35 ℃旋轉蒸發(fā)至干，1.0 mL H2O+CH3CN(3︰1，V/V)定容，過0.22 μm聚四氟乙稀微孔濾膜，供液相色譜串聯(lián)質譜儀測定。

1.5 基質標準工作溶液的制備

取空白草魚樣品，加一系列不同體積的混合標準中間液，按1.4方法處理后，得到質量濃度分別為0.005、0.010、0.050、0.100、0.200、0.500、1.000 μg/mL基質標準工作溶液。

2 結果與討論

2.1 前處理中提取劑的選擇

分別選用甲醇、乙酸乙酯、乙腈等作為提取劑，對陰性草魚進行加標回收實驗，結果如圖1所示。實驗表明，在3種試劑中，甲醇、乙腈兩種提取劑對地塞米松(DX)、醋酸潑尼松龍(PA-46)、諾龍(NT)、醋酸潑尼松(PA-45)、醋酸可的松(CSA)、睪酮(TS)、醋酸地塞米松(DXA)、甲基睪酮(MTS)的提取效率無明顯差異，甲醇、乙腈對醋酸地塞米松(DXA)的提取效率高于乙酸乙酯；但乙酸乙酯對大部分目標化合物的提取效率高于甲醇、乙腈，故本方法選用乙酸乙酯做為提取溶劑。且乙酸乙酯與水不互溶，使得后續(xù)濃縮處理工作簡單、易行。

圖1 3種試劑對目標化合物的提取效率縱坐標數值表示為乙酸乙酯提取率的倍數。DX：地塞米松；PA-46：醋酸潑尼松龍；NT：諾龍；PA-45：醋酸潑尼松；CSA：醋酸可的松；TS：睪酮；DXA：醋酸地塞米松；MTS：甲基睪酮。Fig.1 Extraction efficiency of androgens and glucocorticoids by three different solvents Values of ordinate were expressed as extraction rate based on ethyl acetate．DX：Dexamethasone：PA-46：Prednisolone acetate：NT：Nandrolone；PA-45：Prednisone acetate；CSA：Cortisone acetate；TS：Testosterone；DXA：Dexamethasone acetate；MTS：MethoxVtestosterone.

2.2 質譜條件的優(yōu)化

在質譜中，分別取雄激素和糖皮質激素化合物的單標溶液直接以蠕動泵的注入(10 μL/min)方式引入離子源，選用電噴霧離子源(ESI)，對MS和MS-MS中產生的主要離子分別在正離子的模式下進行鑒定，對各個化合物的霧化氣壓力、干燥氣溫度、干燥氣流速、碎裂電壓、碰撞能量等一系列參數進行優(yōu)化，選擇響應值最高的子離子作為定量離子，次強的子離子做為定性離子進行分析，優(yōu)化后的化合物的質譜參數見表2。

2.3 標準曲線、檢出限、定量限、回收率與精密度

2.3.1 線性范圍、檢出限和定量限

圖2為0.01 μg/mL標準品的多反應監(jiān)測(MRM)色譜圖。由圖2可以看出，雄激素和糖皮質激素化合

圖2 0.01 μg·mL-1標準品的多反應監(jiān)測(MRM)色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of standard of 0.01 μg·mL-1 androgens and glucocorticoids

物實現了良好分離，無雜質干擾峰。地塞米松(DX)、醋酸潑尼松龍(PA-46)、諾龍(NT)、醋酸潑尼松(PA-45)、醋酸可的松(CSA)和醋酸地塞米松(DXA)使用外標法定量；睪酮(TS)以睪酮-D3為內標，甲基睪酮(MTS)以甲基睪酮-D3為內標，采用內標法定量。8種物質擬合得到標準工作曲線，選擇空白魚肉樣品進行加標實驗，根據信噪比S/N≥3作為檢出限，S/N≥10作為定量限，計算各種激素類藥物化合物的檢出限和定量限，檢出限為0.206～0.640 μg/kg，定量限為0.728～2.140 μg/kg，結果見表3。

2.3.2 準確度和精密度

選用陰性的草魚、南美白對蝦等為空白測試基質，分別添加3個濃度水平的激素類化合物的混合標準溶液，每個濃度做6個平行樣，計算添加回收率和相對標準偏差，其結果見表4。實驗結果表明，本方法的平均回收率在75%～115%之間，相對標準偏差(RSD)為1.49%～9.92%(n=6)，方法的準確度與精密度均符合實際分析檢測的要求。

表3 雄激素和糖皮質激素的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限和定量限
Tab.3 Linear ranges, regression equations, related coefficients, limits of detection (LODs) and limits of quantitation (LOQs)for androgens and glucocorticoids

表4 樣品中雄激素和糖皮質激素的添加回收率和相對標準偏差Tab.4 Spiked recoveries and relative standard deviations of androgens and glucocorticoids in samples

2.4 實際樣品分析

將采自福建三明、南平、福州等地的50批次水產品樣品，主要包括草魚、南美白對蝦、大黃魚、鮑、鯉等，按照上述方法進行處理和檢測，50批次樣品均未檢出雄激素和糖皮質激素。

3 結論

本實驗建立了一種同時檢測水產品中雄激素和糖皮質激素的高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜法，該方法前處理方法簡單、快速，同時具有較高的準確度和精密度，適用于水產品中雄激素和糖皮質激素多殘留的測定。

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Simultaneous determination of androgen and glucocorticoid residues in aquaticproducts by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

ZOU Hongmei, ZUO Shunyu, HUANG Dongren, NIU Yuehua, KANG Jianping, ZHANG Tianwen*

(Fujian Marine Environment and Fishery Resources Monitoring Center, Fuzhou 35003, China)

A method for the simultaneous determination of androgen and glucocorticoid residues in aquatic products was developed by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). The samples were extracted with ethyl acetate, followed by clean-up, concentration and other treatments. The chromatographic separation of samples was achieved on Kinetex -C18column (100 mm× 2.1 mm, 2.6 μm) with water/acetonitrile as mobile phase. The target compounds were confirmed and quantified by multiple reaction monitoring (MRM) mode using electrospray ionization source (ESI). Limits of quantification (LOQs) were ranged from 0.728 to 2.140 μg/kg. The average recoveries were between 75% and 115% and the relative standard derivations were in the range of 1.49% - 9.92% in the standard addition levels from 10 to 100 μg/kg. The results showed that the presented method was simple, sensitive, and suitable for quantitative detection of androgen and glucocorticoid residues in aquatic products． [Chinese Fishery Quality and Standards, 2016, 6(2):45-50]

high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; androgen; glucocorticoid; aquatic product; residue

Zhang Tianwen, zhangtw1986@163.com

2015-08-15；接收日期：2016-01-20

福建省社會發(fā)展重點項目(2012Y0005)

鄒紅梅(1978-)，女，高級工程師，研究方向為水產品質量安全檢測，hmzou2000@126.com

張?zhí)炻?，工程師，研究方向為水產品質量安全檢測，zhangtw1986@163.com

S94

：A

：2095-1833(2016)02-0045-06