嚴(yán)國(guó)鴻 江 川 潘旭東

福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350000

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實(shí)驗(yàn)研究

雙藤痹痛凝膠對(duì)CIA大鼠外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用研究

嚴(yán)國(guó)鴻 江 川 潘旭東

福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350000

目的：分析雙藤痹痛凝膠對(duì)膠原免疫性關(guān)節(jié)炎大鼠外周CD+4CD+25FoxP3+Treg細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。方法：Wistar大鼠50只，隨機(jī)分成5組，分別為正常組、模型組、雙藤痹痛凝膠高劑量組、中劑量組、低劑量組，膠原蛋白誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)炎，并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠外周血CD+4CD+25FoxP3+Treg及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清中IL-6表達(dá)水平。結(jié)果：與模型組比較，雙藤痹痛凝膠高、低劑量組大鼠外周血CD+4CD+25T細(xì)胞及CD+4CD+25FoxP3+Treg細(xì)胞水平顯著升高，且高、中劑量組血清IL-6水平顯著下降。結(jié)論：雙藤痹痛凝膠治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎可能通過(guò)上調(diào)外周血CD+4CD+25FoxP3+Treg細(xì)胞表達(dá)水平，降低血清IL-6水平，從而恢復(fù)免疫耐受作用。

雙藤痹痛凝膠劑；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)，是一種慢性全身性自身免疫性疾病，屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，臨床常出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛，腫脹，僵直，變形等癥狀，病情反復(fù)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。雙藤痹痛凝膠為我院院內(nèi)制劑雙藤痹痛酊(批準(zhǔn)文號(hào): 閩藥制 Z20110008) 的基礎(chǔ)上研制而成的新型制劑，凝膠劑是一種以水溶性高分子化合物或親水性物質(zhì)為基質(zhì),與中藥或中藥提取物混合后,涂布于布上制成的外用貼劑，具有透氣性好、載藥量大、耐汗性強(qiáng)，可反復(fù)黏貼，不污染衣物，藥物無(wú)致敏、無(wú)刺激性等副作用。前期臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有抑制 CIA 模型大鼠足趾腫脹和關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變，降低其關(guān)節(jié)炎指數(shù)的作用[2]。近年的研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能與數(shù)量對(duì)RA等自身免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展具有重要的影響，特別是對(duì)CD+4CD+25FoxP3+Treg細(xì)胞的影響，它可能成為治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的新策略和途徑，因此，本文旨在探討雙藤痹痛凝膠是否通過(guò)調(diào)節(jié)CD+4CD+25FoxP3+Treg細(xì)胞，而發(fā)揮抗RA的作用。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物 Wistar大鼠50只，雌雄各半，SPF級(jí)，體重(220±20) g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK(滬)2007-0005，均由福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后開(kāi)始試驗(yàn)。

1.2 藥物與試劑 藥物 雙藤痹痛凝膠，由福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提供，每片(8cm×12cm) 含雷公藤甲素246.59μg，含青藤堿155.89mg；空白凝膠膏劑，由福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提供。試劑弗氏完全佐劑(chondrex公司，批號(hào)：7002)，Ⅱ型膠原(chondrex公司，批號(hào)：2002-2)；APC-抗CD4mAb(批號(hào)：551980)、PE-FoxP3 mAb(批號(hào)：560046)、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(批號(hào)：F1567)均購(gòu)于Bioscience公司，F(xiàn)ITC-抗CD25 mAb(批號(hào)：553071)購(gòu)于Biolegend公司，紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 儀器 CS-1EAS型電子天平(北京市菲姆斯科技開(kāi)發(fā)公司，精度0.1g)；TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)(上海儀分科學(xué)儀器有限公司)；InfiniteM200 Pro多功能酶標(biāo)儀(TECAN)；FACSCalibur型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

2 方法

2.1 大鼠CIA模型的建立[3-4]取50只Wistar大鼠，隨機(jī)分成五組，每組10只，用刮毛刀刮去大鼠背部毛，以供貼藥。將弗氏完全佐劑(FAC)與2mg/mL的Ⅱ型膠原乳液等體積混合，制成1mg/ml的膠原乳劑，除正常組外，按每只大鼠0.2mL乳劑(含CⅡ0.2mg)于尾根部皮下注射造模。7d后強(qiáng)化1次，除正常組外，按每只大鼠0.1mL乳劑(含CⅡ0.1mg)于尾根部皮內(nèi)注射造模。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 除正常組外，其余各組(模型組、雙藤痹痛凝膠膏劑高、中、低劑量組)動(dòng)物初次免疫后次日起開(kāi)始給藥，將藥物貼于大鼠背部后，并用醫(yī)用膠布固定；每日給藥1次，連續(xù)28d。其中模型組為空白凝膠膏劑，大小為2cm×3cm；高、中、低劑量給藥組分別給于大小為1cm×3cm、2cm×3cm、3cm×3cm的雙藤痹痛凝膠膏劑。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD+4CD+25FoxP3+Treg 摘眼球取血,肝素抗凝收集；取血100μL，加入含有0.5μLCD4-FITC和2.5μL CD25-APC單克隆抗體的離心管中，室溫避光孵育30min；加入1mL紅細(xì)胞溶解液混勻，以1500r/min離心5min，棄其上清液；加入1mL透化緩沖液(1×)，以1500r/min離心5min,以試管底部不見(jiàn)紅色為度；棄其上清液，加固定/透化工作液500μL震勻，4℃下避光孵育12h(或過(guò)夜)。加流式染色緩沖液以1500r/min離心5min，清洗，于上述細(xì)胞懸液，加入含有1μL FoxP3-PE單克隆抗體(設(shè)IgG2α為同型對(duì)照)震勻，室溫避光孵育30min，加流式染色緩沖液清洗，加0.1moL/L PBS調(diào)定至300μL,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.4 酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清IL-6表達(dá)水平 眼眶采血，1500rpm/min離心15min制備血清，待測(cè)上清液、標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)抗體使用量均為100μL，參照試劑盒的說(shuō)明書檢測(cè)血清中IL-6的含量。

3 結(jié)果

3.1 外周血CD+4CD+25FoxP3+Treg細(xì)胞水平 采用三色熒光法標(biāo)記進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組大鼠外周血CD+4CD+25T細(xì)胞水平顯著下降，CD+4CD+25T細(xì)胞中FoxP3+T表達(dá)明顯下降(P<0.05或P<0.01)，CD+4CD+25FoxP3-T和CD+4CD+25FoxP3+T表達(dá)水平明顯明顯升高(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，雙藤痹痛凝膠高、低劑量組大鼠外周CD+4CD+25T細(xì)胞水平顯著升高，同時(shí)CD+4CD+25T細(xì)胞中FoxP3+T表達(dá)水平明顯升高，CD+4CD+25FoxP3+T表達(dá)水平顯著下降(P<0.05或P<0.01)。而雙藤痹痛凝膠中劑量組除了CD+4T細(xì)胞及CD+4CD+25FoxP3+T顯著下降外(P<0.01)，其余無(wú)明顯變化。詳見(jiàn)表1、2。

表1 大鼠外周血CD+4CD+25FoxP3+Treg細(xì)胞水平 (%，x±s)

表2 大鼠外周血CD+4CD+25FoxP3+Treg細(xì)胞水平 (%，x±s)

3.2 大鼠血清中IL-6表達(dá)水平 與正常組比較，模型組的IL-6水平顯著升高(P<0.01)，雙藤痹痛凝膠高、中劑量組與模型組比較，均能顯著降低IL-6表達(dá)水平(P<0.05或P<0.01)，而低劑量組無(wú)明顯變化。詳見(jiàn)表3。

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

4 討論

已有文獻(xiàn)研究表明，CD+4CD+25T細(xì)胞的數(shù)量減少或者功能的異?？赡苁怯捎谄鋮⑴c了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)生[5]，而FoxP3(ForkheadboxP3，F(xiàn)oxP3)則是目前公認(rèn)的CD+4CD+25T細(xì)胞特異性標(biāo)志，其基因表達(dá)調(diào)控著免疫T細(xì)胞的產(chǎn)生和成熟，一旦CD+4CD+25FoxP3+Treg細(xì)胞表達(dá)下降，可能直接影響機(jī)體免疫耐受，最終導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生[6]。因此，研究CD+4CD+25T細(xì)胞及其特異性標(biāo)志物FoxP3，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療中具有重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雙藤痹痛凝膠在一定劑量下可降低CD+4T細(xì)胞水平，同時(shí)升高CD+4CD+25T細(xì)胞水平和CD+4CD+25T細(xì)胞中FoxP3+表達(dá)水平，降低IL-6水平。這可能就是前期研究發(fā)現(xiàn)，雙藤痹痛凝膠具有抑制CIA模型大鼠足趾腫脹和關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變，降低其關(guān)節(jié)炎指數(shù)作用機(jī)制之一。

[1]胡蔭奇.風(fēng)濕性疾病診斷治療指南[M].1版.北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,2006:84.

[2]嚴(yán)國(guó)鴻，黃燕，李煌，等.雙藤痹痛凝膠膏劑對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的作用[J].中藥藥理與臨床,2014,01:119-121.

[3]郭應(yīng)強(qiáng)，邱桐，曾昭洋，等.敦煌消痹定痛酊對(duì)膠原誘導(dǎo)性大鼠關(guān)節(jié)炎病理形態(tài)學(xué)的影響[J].中醫(yī)兒科雜志,2007,3(1):14-16.

[4]趙海梅，劉端勇，程紹民，等.Ⅱ型膠原蛋白對(duì)CIA大鼠外周血CD+4CD+25FoxP3+T細(xì)胞的影響[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2011,27(3):290-291.

[5]MorganME,SutmullerRPM,WitteveenHJ,etal.CD25+celldepletionhastenstheonsetofseverediseaseincollagen-inducedarthritis[J].ArthritisRheum, 2003, 48 (5):1452-1460.

[6]HoriS,NomuraT,SakaguchiS，etal.ControlofregulatoryTcelldevelopmentbythetranscriptionfactorFoxp3 [J].Science, 2003, 299(5609):1057-1061.

(編輯：梁志慶)

Regulation Effect of Shuangteng Bitong Cataplasm on Regulatory Treg Cells in Peripheral Blood from Rats with Collagen- Induced Arthritis (CIA)

YAN Guohong JIANG Chuan PAN Xudong

People’s Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350000，China

Objective To analyse the regulation effect of Shuangteng Bitong Cataplasm on CD+4CD+25FoxP3+Treg Cell in Peripheral Blood from Rats with Collagen- Induced Arthritis (CIA). Methods Fifty Wistar rats were randomly divided into 5 groups，normal control group，model control group，high-dose，middle-dose and low-dose Shuangteng Bitong Cataplasm group. Rats' arthritis was induced by collagen. The number of CD+4CD+25FoxP3+Treg cell in peripheral blood was tested by flow cytometry，and the level of IL-6 in serum was detected by enzyme linked immunosorbent assay. Results Compared with the model groups, the levels of CD+4CD+25FoxP3+Treg cell and CD+4CD+25FoxP3+Treg cell were increased obviously in the high and low dose of Shuangteng Bitong Cataplasm groups, while the level of IL- 6 in serum was decreased remarkably in the middle and high-dose of Shuangteng Bitong Cataplasm groups.Conclusion It is realized that Shuangteng Bitong Cataplasm effectively treat RA by regulating the level of Treg cell and reducing IL-6 gene expression to restore immunological tolerance.

Shuangteng Bitong Gel Cream; Rheumatoid Arthritis; Regulatory T Cells

2016-10-20

福建省科技廳引導(dǎo)性項(xiàng)目(2015Y0060)。

嚴(yán)國(guó)鴻(1971-),男，漢族，碩士，副主任藥師，研究方向?yàn)橹兴幹苿┘百|(zhì)量控制研究。E-mail：yangh8888@163.com

R

A

1007-8517(2016)23-0033-03