郭 琦 劉 燦 海 寶 馬 騰 王 紅 宋純理 徐迎勝

(北京大學(xué)第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100083)

·實(shí)驗(yàn)研究·

殼聚糖導(dǎo)管填充辛伐他汀/泊洛沙姆407水凝膠促進(jìn)大鼠坐骨神經(jīng)缺損后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)*

郭 琦 劉 燦①海 寶①馬 騰①王 紅①宋純理①徐迎勝**

(北京大學(xué)第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100083)

目的 探討殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀/泊洛沙姆407水凝膠對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)缺損后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響。方法選取成年SD大鼠40只，隨機(jī)分成殼聚糖導(dǎo)管組、殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀0 mg水凝膠組、殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀0.5 mg水凝膠組和殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀1 mg水凝膠組(前2組為對(duì)照組，后2組為辛伐他汀治療組)，每組10只，制作左側(cè)坐骨神經(jīng)10 mm缺損模型，用殼聚糖導(dǎo)管橋接缺損，其內(nèi)填充不同濃度的辛伐他汀水凝膠。術(shù)后4、6、8、10周進(jìn)行坐骨神經(jīng)指數(shù)檢測(cè)，術(shù)后10周進(jìn)行神經(jīng)電生理、熒光金逆行示蹤、腓腸肌相對(duì)濕重、肌纖維面積百分比和運(yùn)動(dòng)終板形態(tài)檢測(cè)，觀察神經(jīng)缺損后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況。結(jié)果術(shù)后4、6、8、10周，辛伐他汀治療組的坐骨神經(jīng)指數(shù)均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；術(shù)后10周辛伐他汀治療組復(fù)合肌肉動(dòng)作電位的峰-峰值、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度、熒光金標(biāo)記的陽性神經(jīng)元數(shù)量、腓腸肌相對(duì)濕重、肌纖維面積百分比和運(yùn)動(dòng)終板的恢復(fù)均顯著優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀/泊洛沙姆407水凝膠能夠促進(jìn)外周神經(jīng)損傷后的功能恢復(fù)。

周圍神經(jīng)缺損； 辛伐他??； 殼聚糖導(dǎo)管； 泊洛沙姆407水凝膠； 功能恢復(fù)； 神經(jīng)再支配

外周神經(jīng)損傷一直是臨床上棘手的難題，并且會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)缺損、靶肌肉萎縮和運(yùn)動(dòng)功能障礙[1]。對(duì)于短距離缺損，端端吻合即可達(dá)到治愈的目的。對(duì)于長(zhǎng)距離神經(jīng)缺損，自體神經(jīng)移植仍然是外周神經(jīng)缺損治療的金標(biāo)準(zhǔn)[2]。但是由于供區(qū)功能障礙、供體神經(jīng)來源有限等原因，自體神經(jīng)移植在臨床的應(yīng)用受到很大限制[3]。因此，人們嘗試各種人工神經(jīng)移植物以期能替代自體神經(jīng)移植來促進(jìn)神經(jīng)再生[4，5]。

殼聚糖作為一種天然高分子聚合物，由于其低毒性、良好的生物可降解性和組織相容性而被廣泛應(yīng)用于基因載體、細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程中[6～8]。有研究顯示殼聚糖導(dǎo)管能促進(jìn)神經(jīng)再生和功能恢復(fù)[9，10]。然而，缺乏內(nèi)部填充材料的單孔神經(jīng)導(dǎo)管對(duì)于長(zhǎng)距離神經(jīng)缺損再生和功能恢復(fù)均不理想[11，12]。泊洛沙姆407水凝膠具有良好的生物組織相容性、穩(wěn)定性、低毒性、低免疫原性，在體環(huán)境下實(shí)現(xiàn)液相-固相轉(zhuǎn)變，填充于神經(jīng)導(dǎo)管中，不僅能實(shí)現(xiàn)緩釋藥物的功能，還能形成三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，為新生組織長(zhǎng)入提供機(jī)械支持和發(fā)育引導(dǎo)[13，14]。Xavier等[15]和我們的前期研究[16，17]表明，不管在周圍神經(jīng)損傷還是中樞神經(jīng)損傷中，辛伐他汀均能顯著促進(jìn)損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)。

我們的前期實(shí)驗(yàn)制備殼聚糖導(dǎo)管/辛伐他汀/泊洛沙姆407水凝膠復(fù)合材料，并證實(shí)其能夠顯著促進(jìn)神經(jīng)缺損后的結(jié)構(gòu)重建。周圍神經(jīng)缺損后，神經(jīng)軸突斷裂，神經(jīng)功能完全喪失，只有當(dāng)神經(jīng)缺損被移植物橋接，再生的神經(jīng)軸突通過移植物長(zhǎng)到遠(yuǎn)端效應(yīng)器，神經(jīng)功能才能恢復(fù)。組織學(xué)上結(jié)構(gòu)修復(fù)的成功并不一定代表運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的成功。對(duì)人工神經(jīng)修復(fù)材料更重要的評(píng)價(jià)是功能恢復(fù)，而不是簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)修復(fù)。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索該復(fù)合材料對(duì)于神經(jīng)缺損大鼠的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響，旨在為今后進(jìn)一步實(shí)施大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

辛伐他汀原料藥(中國藥品生物制品檢定所)；殼聚糖(中國浙江金殼藥業(yè))；泊洛沙姆407(德國BASF公司)；熒光金(美國Fluorochrome公司)；一抗α-金環(huán)蛇毒素(美國Sigma公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司)；熒光顯微鏡(德國Leica公司)；肌電誘發(fā)電位儀(美國Candwell公司)。

1.2 動(dòng)物分組及給藥

標(biāo)準(zhǔn)分籠飼養(yǎng)的SD大鼠45只，SPF級(jí)，雄性，6～7周齡，體重250～300 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部[SCXK(京)2011-0012]提供，采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只：殼聚糖導(dǎo)管組(conduit)；殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀0 mg水凝膠組(c+sim 0 mg)；殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀0.5 mg水凝膠組(c+sim 0.5 mg)；殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀1 mg水凝膠組(c+sim 1 mg)。剩余5只為正常大鼠。

1.3 殼聚糖導(dǎo)管和辛伐他汀/泊洛沙姆407溫敏水凝膠的制備

殼聚糖導(dǎo)管的制備參考文獻(xiàn)[18]，略微改良。殼聚糖粉末溶解在冰醋酸中達(dá)到8%。外徑為1.6 mm的玻璃毛細(xì)管豎直插入殼聚糖溶液中，豎直拔出，再浸入5% NaOH溶液中30分鐘，雙蒸水反復(fù)沖洗直至中性(pH=7)。最后，拔出玻璃毛細(xì)管留下殼聚糖導(dǎo)管，切成14 mm長(zhǎng)度的節(jié)段備用。泊洛沙姆407粉末溶解在雙蒸水中達(dá)到25%，添加辛伐他汀至3種劑量，分別為每20 μl混懸液中含有0、0.5和1 mg辛伐他汀。

1.4 外周神經(jīng)損傷模型制作

麻醉后，消毒備皮，于左側(cè)大腿外側(cè)切開皮膚、皮下，沿肌間隙分離暴露坐骨神經(jīng)，于梨狀肌下孔5 mm處完全橫斷坐骨神經(jīng)，造成10 mm缺口，兩端用9-0縫線縫合殼聚糖導(dǎo)管，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組填充不同劑量辛伐他汀水凝膠。示意圖見圖1。傷口處灑青霉素粉末以防感染，分層縫合肌肉與皮膚。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，每籠3只。術(shù)后觀察大鼠精神狀態(tài)、術(shù)側(cè)肢體活動(dòng)、飲食、傷口愈合情況等。

1.5 行為學(xué)檢測(cè)

根據(jù)文獻(xiàn)介紹的常規(guī)方法[19～21]，各組隨機(jī)挑選8只大鼠分別于術(shù)后4、6、8、10周進(jìn)行坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(sciatic functional index，SFI)檢測(cè)試驗(yàn)。自制大鼠足印行走箱，寬10 cm，長(zhǎng)50 cm，箱底放置白紙，于大鼠足底涂抹碘伏讓其在箱內(nèi)行走并記錄足印。SFI的計(jì)算公式[22]：SFI=-38.3×(EPL-NPL)/NPL+109.5×(ETS-NTS)/NTS+13.3×(EITS-NITS)/NITS-8.8，其中PL代表三趾尖到足跟的腳掌長(zhǎng)度，TS代表一、五趾間距離，ITS代表二、四趾間距離，E和N分別代表實(shí)驗(yàn)側(cè)和正常側(cè)。SFI數(shù)值為0代表功能正常，SFI數(shù)值趨近-100表示功能近于完全喪失，達(dá)到甚至超過-100表示功能完全喪失。

1.6 神經(jīng)電生理檢查

取5只正常大鼠，與從各組隨機(jī)挑選出的5只大鼠于術(shù)后10周進(jìn)行神經(jīng)電生理檢測(cè)。麻醉后暴露坐骨神經(jīng)，雙極勾狀刺激電極分別置于移植物的兩端，單極針狀記錄電極插入腓腸肌內(nèi)，記錄復(fù)合肌肉動(dòng)作電位(compound muscle action potential，CMAP)。分別計(jì)算CMAP的峰-峰值和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(motor nerve conduction velocity，MNCV)。MNCV(m/s)=近遠(yuǎn)端刺激點(diǎn)間的距離(mm)/近遠(yuǎn)端刺激動(dòng)作電位的潛伏期差值(ms)，其中在大鼠坐骨神經(jīng)近遠(yuǎn)端刺激點(diǎn)間的距離為10 mm，近端刺激動(dòng)作電位的潛伏期差值為潛伏期2-潛伏期1，因此公式可簡(jiǎn)化為MNCV=10/(潛伏期2-潛伏期1)。

1.7 熒光金逆行示蹤

每組隨機(jī)挑選4只大鼠于術(shù)后10周進(jìn)行熒光金逆行示蹤。麻醉后再次暴露坐骨神經(jīng)，于移植物遠(yuǎn)端5 mm處用微量注射器注射5%熒光金-磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)溶液。1周后取L4～L6背根神經(jīng)節(jié)，利用OCT包埋劑(optimal cutting temperature compound)進(jìn)行包埋，于冰凍切片機(jī)上縱切片厚度為16 μm。在熒光顯微鏡下分別于10倍和20倍隨機(jī)選取4個(gè)視野進(jìn)行觀察，并利用Image-pro Plus6.0計(jì)數(shù)熒光金標(biāo)記的陽性細(xì)胞。

1.8 腓腸肌的恢復(fù)和神經(jīng)再支配

將進(jìn)行熒光金逆行示蹤之外的剩余每組6只大鼠于術(shù)后10周通過注射過量麻醉劑處死，大鼠雙側(cè)腓腸肌自肌肉起止點(diǎn)完整切取，分別稱取實(shí)驗(yàn)側(cè)和正常側(cè)的濕重并相除，算出相對(duì)濕重(relative gastrocnemius muscle weight，RGMW)，其中5只于中性福爾馬林中固定、脫水、石蠟包埋，橫切片5 μm，Masson染色，在光學(xué)顯微鏡下于20倍隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察，并利用Image-pro Plus6.0分析肌纖維面積百分比。余1只腓腸肌樣本于4%多聚甲醛中固定，30%蔗糖溶液中脫水，OCT包埋劑進(jìn)行包埋，縱切片16 μm，孵育一抗α-金環(huán)蛇毒素(標(biāo)記運(yùn)動(dòng)終板)，4 ℃，過夜，PBS水洗，甘油封片，在熒光顯微鏡下分別于10倍和40倍觀察標(biāo)記形態(tài)，正常的運(yùn)動(dòng)終板數(shù)量多且形態(tài)偏卵圓形。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)結(jié)果

見圖2，辛伐他汀0.5 mg和1 mg組的實(shí)驗(yàn)側(cè)腳趾分開，且抓地有力，接近正常側(cè)腳趾。術(shù)后4、6、8、10周，4組SFI均呈逐漸上升的趨勢(shì)，其中辛伐他汀0.5 mg組和1 mg組的SFI顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。辛伐他汀0 mg組和導(dǎo)管組間無顯著性差異(P>0.05)。具體統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)見表1。

表1 4組術(shù)后4、6、8、10周大鼠坐骨神經(jīng)指數(shù)(SFI)比較

注：conduit，殼聚糖導(dǎo)管組；c+sim 0 mg，殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀0 mg水凝膠；c+sim 0.5 mg，殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀0.5 mg水凝膠；c+sim 1 mg，殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀1 mg水凝膠

與殼聚糖導(dǎo)管組比較，##P<0.01；與殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀0 mg水凝膠組比較，**P<0.01；與殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀0.5 mg水凝膠組比較,※P<0.05

2.2 神經(jīng)電生理結(jié)果

見圖3，辛伐他汀治療組的CMAP的峰-峰值和MNCV明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。這些參數(shù)于導(dǎo)管組中達(dá)最低值，辛伐他汀0 mg組和導(dǎo)管組無顯著性差異(P>0.05)。具體統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)見表2。

2.3 熒光金逆行示蹤

見圖4，4組中的背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)中均可見熒光金標(biāo)記的神經(jīng)元的存在。辛伐他汀0.5 mg和1 mg組中的陽性細(xì)胞數(shù)相似，但均明顯多于辛伐他汀0 mg組和導(dǎo)管組(P<0.01)。具體統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)見表3。

組別神經(jīng)電生理CMAP峰-峰值(mV)MNCV(m/s)normal29.38±1.2650.05±1.77conduit1.46±1.324.08±3.60c+sim0mg2.90±1.534.00±2.76c+sim0.5mg8.42±5.72##/*17.03±9.38#/*c+sim1mg10.36±5.47##/**23.47±18.00##/**F值45.78320.547P值0.0000.000

注：normal，正常組；conduit，殼聚糖導(dǎo)管組；c+sim 0 mg，殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀0 mg水凝膠；c+sim 0.5 mg，殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀0.5 mg水凝膠；c+sim 1 mg，殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀1 mg水凝膠

與殼聚糖導(dǎo)管組比較,#P<0.05，##P<0.01；與殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀0 mg水凝膠組比較,*P<0.05，**P<0.01

圖1 殼聚糖導(dǎo)管填充、注射辛伐他汀水凝膠橋接坐骨神經(jīng)缺損示意圖 圖2 A和B為術(shù)后10周大鼠步態(tài)分析的有代表性的印跡圖，C為術(shù)后4、6、8、10周SFI的統(tǒng)計(jì)圖(n=8) 圖3 術(shù)后10周神經(jīng)電生理結(jié)果：A為各組CMAP的代表性圖[圖中箭頭1為波峰，箭頭2為波谷，三角1為潛伏期1，三角2為潛伏期2，MNCV=10/(潛伏期2-潛伏期1)]，B和C分別為CMAP的峰-峰值和MNCV的統(tǒng)計(jì)圖(n=5) normal，正常組；conduit，殼聚糖導(dǎo)管組；c+sim 0 mg，殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀0 mg水凝膠；c+sim 0.5 mg，殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀0.5 mg水凝膠；c+sim 1 mg，殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀1 mg水凝膠與殼聚糖導(dǎo)管組比較，#P<0.05，##P<0.01；與殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀0 mg水凝膠組比較， *P<0.05，**P<0.01

組別熒光金標(biāo)記陽性細(xì)胞數(shù)(個(gè))conduit82.81±30.36c+sim0mg118.81±22.19c+sim0.5mg170.55±10.79##/*c+sim1mg176.81±36.47##/*F值11.144P值0.001

注：conduit，殼聚糖導(dǎo)管組；c+sim 0 mg，殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀0 mg水凝膠；c+sim 0.5 mg，殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀0.5 mg水凝膠；c+sim 1 mg，殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀1 mg水凝膠

與殼聚糖導(dǎo)管組比較,##P<0.01；與殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀0 mg水凝膠組比較,*P<0.05

2.4 腓腸肌恢復(fù)和神經(jīng)再支配情況

見圖5，辛伐他汀治療組的腓腸肌幾乎恢復(fù)為正常腓腸肌的形態(tài)，而對(duì)照組的腓腸肌嚴(yán)重萎縮。辛伐他汀治療組的RGMW顯著增高(P<0.05)。在辛伐他汀治療組中α-金環(huán)蛇毒素標(biāo)記的運(yùn)動(dòng)終板的數(shù)目和形態(tài)明顯好于對(duì)照組。Masson染色表明辛伐他汀治療組中的腓腸肌肌纖維面積百分比顯著大于對(duì)照組(P<0.05)。具體統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)見表4。

組別腓腸肌相對(duì)濕重(%)肌纖維面積百分比(%)normal76.56±2.40conduit24.53±5.3754.72±4.79c+sim0mg25.58±11.9756.34±2.80c+sim0.5mg48.53±11.78##/*66.15±10.60#/*c+sim1mg50.06±17.33##/**67.24±8.37##/*F值6.4249.058P值0.0050.000

注：normal，正常組；conduit，殼聚糖導(dǎo)管組；c+sim 0 mg，殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀0 mg水凝膠；c+sim 0.5 mg，殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀0.5 mg水凝膠；c+sim 1 mg，殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀1 mg水凝膠

與殼聚糖導(dǎo)管組比較，#P<0.05，##P<0.01；與殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀0 mg水凝膠組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

外周神經(jīng)損傷是臨床常見損傷，神經(jīng)缺損是損傷中最為棘手的難題。我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀/泊洛沙姆407水凝膠可以顯著促進(jìn)大鼠缺損10 mm的坐骨神經(jīng)再生。但是結(jié)構(gòu)上的修復(fù)不一定表示功能上也能得到重建，神經(jīng)損傷修復(fù)的最終目的就是恢復(fù)運(yùn)動(dòng)功能。

本實(shí)驗(yàn)從不同的角度來驗(yàn)證殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀/泊洛沙姆407水凝膠對(duì)于神經(jīng)缺損后的功能恢復(fù)的影響。首先，SFI是目前公認(rèn)的一種較有效的行為學(xué)評(píng)價(jià)方法，可以很好地反映肌肉肌力的恢復(fù)[23]。隨時(shí)間延續(xù)，大鼠神經(jīng)再生，各組SFI不斷升高，而辛伐他汀治療組的SFI從4周開始一直都顯著高于對(duì)照組，且貫穿于整個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程；其次，術(shù)后10周，辛伐他汀治療組的再生神經(jīng)的CMAP的峰-峰值和MNCV明顯高于對(duì)照組，表明其神經(jīng)傳導(dǎo)功能得到了極大的恢復(fù)。神經(jīng)傳導(dǎo)速度是反映受損神經(jīng)功能恢復(fù)的直接證據(jù)；然后，作為神經(jīng)元的一項(xiàng)基本活動(dòng)，軸漿流動(dòng)是聯(lián)系神經(jīng)元與末梢，運(yùn)送相關(guān)物質(zhì)的通道，是再生神經(jīng)功能恢復(fù)的重要證明[24]。本實(shí)驗(yàn)中辛伐他汀治療組的背根神經(jīng)節(jié)中熒光金標(biāo)記的陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組，證實(shí)再生神經(jīng)恢復(fù)了軸漿流動(dòng)。

更重要的是，再生神經(jīng)對(duì)運(yùn)動(dòng)功能的影響最終體現(xiàn)于靶器官的神經(jīng)支配[25]。當(dāng)周圍神經(jīng)離斷后，由于傳導(dǎo)功能障礙，肌纖維失去神經(jīng)的營養(yǎng)作用，靶肌肉最終形成廢用性萎縮，導(dǎo)致肌纖維數(shù)目下降，體積減小，膠原纖維增生[26]。本實(shí)驗(yàn)中辛伐他汀治療組的術(shù)側(cè)腓腸肌RGMW顯著高于對(duì)照組；Masson染色顯示辛伐他汀治療組的肌纖維面積百分比相對(duì)于對(duì)照組顯著增大，膠原纖維顯著減少；且辛伐他汀治療組中α-金環(huán)蛇毒素標(biāo)記的運(yùn)動(dòng)終板的乙酰膽堿受體(AChR)的形態(tài)和數(shù)量均明顯優(yōu)于對(duì)照組。以上結(jié)果均表明隨神經(jīng)再生，其靶肌肉接受神經(jīng)營養(yǎng)的作用，運(yùn)動(dòng)終板也得以修復(fù)，重獲神經(jīng)支配，使運(yùn)動(dòng)功能得到改善，與SFI的結(jié)果相互一致。

水凝膠是一種具有良好的生物降解性和組織相容性的聚合物，能夠作為多種藥物或分子的載體[27]。水凝膠在空間上分散形成三維立體結(jié)構(gòu)，能夠提供誘導(dǎo)軸突生長(zhǎng)連接斷端的結(jié)構(gòu)支撐，從而促進(jìn)神經(jīng)再生[28]。已有研究顯示泊洛沙姆407水凝膠能夠作為慢病毒載體攜帶治療基因促進(jìn)大鼠脊髓損傷后的神經(jīng)再生和功能恢復(fù)[29，30]。因此，我們將辛伐他汀與泊洛沙姆407水凝膠復(fù)合在一起，既能達(dá)到緩釋他汀的效果，延長(zhǎng)其作用時(shí)間，又能減少不良的系統(tǒng)反應(yīng)。

使用可注射溫敏性泊洛沙姆水凝膠作為辛伐他汀的載體填充殼聚糖導(dǎo)管具有以下優(yōu)點(diǎn)：首先，可注射水凝膠能夠填充任何形狀的神經(jīng)導(dǎo)管，不留空隙，可以更好地引導(dǎo)軸突生長(zhǎng)；其次，水凝膠的溫敏性使其在體內(nèi)37 ℃即可實(shí)現(xiàn)從液相到固相的轉(zhuǎn)變，不需提前干預(yù)，更便于臨床應(yīng)用；最后，殼聚糖導(dǎo)管的機(jī)械強(qiáng)度適合縫合和移植，復(fù)合可注射水凝膠能達(dá)到促進(jìn)神經(jīng)纖維長(zhǎng)入的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

本研究采用的辛伐他汀劑量為0.5、1 mg， 均顯示可顯著促進(jìn)大鼠周圍神經(jīng)損傷修復(fù)。但除了第4周時(shí)SFI顯示辛伐他汀1 mg優(yōu)于0.5 mg，而在之后的恢復(fù)過程中并沒有顯著性差異，本實(shí)驗(yàn)的目的是驗(yàn)證辛伐他汀治療能有效促進(jìn)外周神經(jīng)再生，那么如果將劑量減小到0.5 mg以下，能否與對(duì)照組相比還具有顯著的優(yōu)勢(shì)呢？這將會(huì)是我們未來研究的一個(gè)內(nèi)容。同時(shí)，泊洛沙姆水凝膠的體外降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其2周內(nèi)即基本完全降解，提示延長(zhǎng)緩釋時(shí)間或?qū)⒏玫匕l(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)再生的作用。這對(duì)于材料優(yōu)化以及未來轉(zhuǎn)化研究具有重要的意義。

圖4 熒光金逆行示蹤：A為術(shù)后10周背根神經(jīng)節(jié)中熒光金的標(biāo)記情況(上圖標(biāo)尺為100 μm，下圖標(biāo)尺為50 μm)；B為熒光金(fluoro gold，F(xiàn)G)標(biāo)記細(xì)胞數(shù)目的統(tǒng)計(jì)圖(n=4) 圖5 術(shù)后10周腓腸肌恢復(fù)和神經(jīng)再支配情況:C為同一只大鼠實(shí)驗(yàn)側(cè)(左)和正常側(cè)(右)腓腸肌的大體情況，A為RGMW統(tǒng)計(jì)圖；D為實(shí)驗(yàn)側(cè)腓腸肌Masson染色(圖標(biāo)尺為50 μm)，B為肌纖維面積百分比統(tǒng)計(jì)圖；E為α-金環(huán)蛇毒素標(biāo)記運(yùn)動(dòng)終板乙酰膽堿受體(AChR)的形態(tài)圖(上圖標(biāo)尺為100 μm，下圖標(biāo)尺為25 μm)normal，正常組；conduit，殼聚糖導(dǎo)管組；c+sim 0 mg，殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀0 mg水凝膠；c+sim 0.5 mg，殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀0.5 mg水凝膠；c+sim 1 mg，殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀1 mg水凝膠與殼聚糖導(dǎo)管組比較，#P<0.05，##P<0.01；與殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀0 mg水凝膠組比較，*P<0.05，**P<0.01

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合辛伐他汀/泊洛沙姆407水凝膠能夠顯著促進(jìn)大鼠坐骨神經(jīng)缺損后的神經(jīng)再生和運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。

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(修回日期：2016-05-03)

(責(zé)任編輯：王惠群)

Bridging Sciatic Nerve Defect with Simvastatin Delivered by Injectable Thermosensitive Pluronic F-127 Hydrogel Promotes Nerve Regeneration in Rats

GuoQi*,LiuCan,HaiBao,etal.

*DepartmentofNeurology,PekingUniversityThirdHospital,Beijing100083,China

XuYingsheng,E-mail:xys@bjmu.edu.cn

Objective To investigate effects of simvastatin/pluronic F-127 hydrogel combined with chitosan conduit on motor functional recovery of rats with sciatic nerve defects. Methods A total of 40 adult Sprague-Dawley rats were assigned randomly into four groups:chitosan conduit group and groups of the conduit filled with pluronic F-127 hydrogel containing 0 mg,0.5 mg,and 1 mg simvastatin (the first two groups were control groups while the last two groups as simvastatin treated groups),with 10 rats in each group. A 10 mm gap was produced in left side of sciatic nerves and then was repaired by the chitosan conduit filled with pluronic F-127 hydrogel containing different doses of simvastatin. At different periods after surgery,the functional recovery was evaluated by sciatic functional index (SFI),electrophysiology,fluoro-gold retrograde tracing,the relative gastrocnemius muscle weight (RGMW),the percentage area of muscle fibers and the morphology of motor endplates. Results At 4,6,8,and 10 weeks after surgery,values of SFI in simvastatin treated groups were significantly higher than those in the control groups (P<0.05). Similarly,at 10 weeks after surgery,the peak amplitude and motor nerve conduction velocity of compound muscle action potential (CMAP),number of FG-labled neurons,RGMW,the percentage area of muscle fibers and the morphology of motor endplates in simvastatin treated groups were superior to those in the control groups (P<0.05). Conclusion These findings indicate that filling chitosan conduits with simvastatin/ pluronic F-127 hydrogel can improve motor functional recovery in rats.

Peripheral nerve defect; Simvastatin; Chitosan conduit; Pluronic F-127 hydrogel; Functional recovery;Reinnervation

國家自然科學(xué)基金(No.81171693，No.81100895)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(No.SS2015AA020304)

**通訊作者，E-mail：xys@bjmu.edu.cn

①骨科

A

1009-6604(2016)07-0638-07

10.3969/j.issn.1009-6604.2016.07.017

2016-03-21)