武 東，孫 琳，李常虹，楊 麟，趙金霞，劉湘源

(北京大學第三醫(yī)院風濕免疫科， 北京 100191)

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·論著·

抗瓜氨酸化葡萄糖-6-磷酸異構酶多肽抗體的檢測及其在類風濕關節(jié)炎中的意義

武 東，孫 琳，李常虹，楊 麟，趙金霞△，劉湘源△

(北京大學第三醫(yī)院風濕免疫科， 北京 100191)

目的：檢測類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)患者血清中抗瓜氨酸化葡萄糖-6-磷酸異構酶(citrullinated glucose-6-phosphate isomerase，C-GPI)70～88肽抗體(抗C-GPI70～88抗體)和抗C-GPI 435～453肽抗體(抗C-GPI435～453抗體)的水平，同時檢測其原型多肽抗體水平，評價抗C-GPI多肽抗體在RA診斷中的價值。方法： 應用酶聯(lián)免疫吸附法檢測191例RA患者、129例其他風濕免疫疾病患者和74例健康對照組血清中抗C-GPI70～88抗體、抗C-GPI435～453抗體、抗GPI70～88抗體和抗GPI435～453抗體的水平，并收集RA患者臨床和實驗室檢查數(shù)據(jù)，分析抗C-GPI多肽抗體在RA診斷中的價值以及與臨床和實驗室指標的相關性。結果： (1)RA組抗C-GPI70～88抗體和抗C-GPI435～453抗體的滴度(68.71±4.20和51.78±3.13)顯著高于疾病對照組和健康對照組(P<0.05)，而抗GPI70～88抗體和抗GPI435～453抗體的滴度在各組中差異無統(tǒng)計學意義。(2)抗C-GPI70～88抗體在RA診斷中的敏感性為41.88%，特異性為84.50%；抗C-GPI435～453抗體在RA診斷中的敏感性為46.05%，特異性為86.05%;聯(lián)合檢測兩種抗瓜氨酸化多肽抗體的敏感性為50.79%，特異性為86.05%。(3)抗C-GPI70～88抗體和抗C-GPI435～453抗體在類風濕因子、抗角蛋白抗體、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體均陰性的RA患者中的陽性率分別為35.00%和45.00%。(4)RA患者抗C-GPI70～88抗體和抗C-GPI435～453抗體陽性組和陰性組之間臨床和實驗室指標差異無統(tǒng)計學意義。結論： RA患者體內可以檢測到抗C-GPI多肽抗體，C-GPI可能參與了RA的發(fā)病，對于血清陰性的RA患者有較好的診斷價值。

關節(jié)炎，類風濕；瓜氨酸化；葡萄糖-6-磷酸異構酶

瓜氨酸化抗原在類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)的異常免疫反應中起重要作用[1]，抗瓜氨酸化蛋白抗體(anti-citrullinated protein antibodies，ACPA)是RA的特異性抗體，在RA的診斷中具有重要意義。近年來研究發(fā)現(xiàn)，多種瓜氨酸化抗原參與RA的發(fā)病，如瓜氨酸化波形蛋白、瓜氨酸化纖維蛋白原、瓜氨酸化Ⅱ型膠原等。以往的研究已證實葡萄糖-6-磷酸異構酶(glucose-6-phosphate isome-rase，GPI)是RA的自身抗原，但關于其瓜氨酸化蛋白的研究很少。2013年Umeda等[2]首次研究發(fā)現(xiàn)RA患者血清中可以檢測到抗瓜氨酸化GPI(ci-trullinated GPI，C-GPI)多肽抗體，其中70～88肽和435～453肽的瓜氨酸化形式抗體對RA的診斷具有較高的敏感性和特異性，可能是RA診斷的標記性抗體并與疾病活動性相關。

為進一步評價抗C-GPI多肽抗體在RA中的意義，本研究合成GPI70～88和GPI435～453兩條多肽的原型，并以瓜氨酸替代序列中的兩個精氨酸合成多肽的瓜氨酸化形式C-GPI70～88和C-GPI435～453，在多肽兩端加半胱氨酸進行環(huán)化得到4條多肽。以酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)方法檢測RA組和對照組血清中上述4條多肽的抗體水平，并評價其在RA中的意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

共收集血清標本394份，包括：(1)RA組191例，均為2014年9月至2015年9月北京大學第三醫(yī)院風濕免疫科住院或門診患者，所有患者符合2010年美國風濕病學會(American College of Rheumatology，ACR)修訂的RA分類標準，其中男性65例、女性126例，平均年齡(57.08±1.42)歲；(2)其他風濕免疫疾病組(疾病對照組)129例，其中男性48例、女性81例，平均年齡(47.50±1.65)歲，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)36例、骨關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)41例、強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)17例、痛風(gout)8例和其他結締組織病(系統(tǒng)性血管炎、干燥綜合征、未分化結締組織病)27例，均符合相應疾病的國際分類標準；(3)正常對照組74例，為體檢健康人員，其中男性30例、女性44例，平均年齡(49.20±1.37)歲。上述3組對象年齡、性別差異均無統(tǒng)計學意義，各組血清均來源于臨床檢驗的剩余標本。本研究經(jīng)北京大學第三醫(yī)院醫(yī)學科學研究倫理委員會批準，所有受試者均知情同意。

1.2 合成多肽

GPI多肽原型序列：(1)GPI70～88：CDLAKSRG-VEAARERMFNGEC(70～88)；(2)GPI435～453：CALMRGKSTEEARKELQAAGC(435～453)；C-GPI多肽序列：(1)C-GPI70～88：CDLAKSXGVEAAXERMFNGEC(X代表瓜氨酸)；(2)C-GPI435～453：CALMX-GKSTEEAXKELQAAGC。4條多肽兩端加半胱氨酸進行環(huán)化。以上多肽委托北京中科亞光生物科技有限公司合成，純度95%。

1.3 血清中多肽抗體的檢測

以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)稀釋多肽，終濃度10 mg/L，包被96孔板，100 μL/孔，4 ℃過夜；加入50 g/L牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)-PBS，300 μL/孔，4 ℃封閉過夜；用3%BSA-PBS按1 ∶200稀釋患者及對照組血清，100 μL/孔，室溫2 h；0.05%(體積分數(shù))磷酸鹽吐溫緩沖液洗板5次，300 μL/孔；加入山羊抗人免疫球蛋白G(immunoglobulin G, IgG)(辣根過氧化物酶標記)， 濃度1 ∶1 000，100 μL/孔，室溫1 h；0.05%磷酸鹽吐溫緩沖液洗板5次，300 μL/孔；采用3, 3′, 5, 5′-四甲基聯(lián)苯胺(3, 3′, 5, 5′-tetramethyl benzidine，TMB)底物顯色試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)避光顯色20 min，加入終止液，置于酶標儀中，450 nm波長下讀取光密度值，即吸光度值(absorbance, A)。所有樣品均做復孔，每板均設陽性對照和陰性對照。吸光度單位(absorbance unit，AU)值=(A待測血清-A非特異背景)/(A標準血清-A非特異背景)×100，標準血清為陽性標準血清。

1.4 其他實驗室指標

收集患者的臨床資料及實驗室指標，臨床指標包括：性別、年齡、病程長短、有無間質性肺炎患者胸部X線檢查結果提示肺間質纖維化定為陽性)、疾病活動度評分(disease activity score 28-erythrocyte sedimentation rate，DAS28-ESR)；實驗室指標包括: 抗環(huán)瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)抗體和抗角蛋白抗體(anti-keratin antibody，AKA)、類風濕因子(rheumatoid factor，RF)、紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)等。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 抗C-GPI70～88抗體和抗GPI70～88抗體在RA及對照組中的水平

抗C-GPI70～88抗體在各組患者中的滴度分別為：RA組68.71±4.20、健康對照組46.12±3.50、OA組44.45±3.49、SLE組40.09±3.89、AS組35.23±3.09、痛風組31.74±5.07、其他結締組織病組36.26±2.63，各組之間差異有統(tǒng)計學意義(單因素方差分析，F(xiàn)=6.219，P<0.001)，RA患者IgG型抗C-GPI70～88抗體滴度顯著高于健康對照組(46.12±3.50)和疾病對照組(39.93±1.75)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1)，而RA患者IgG型抗GPI70～88抗體滴度均值(42.74±2.60)與健康對照組(48.44±3.60)和疾病對照組(36.66±2.10)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖2)。

Abbreviations as in Figure 1.

圖2 RA組、健康對照組及疾病對照組抗GPI抗體滴度(AU值)的比較

Figure2 Comparison of the titers (AU value) of anti-GPIantibody in RA patients, healthy controls and disease controls

2.2 抗C-GPI435～453抗體和抗GPI435～453抗體在RA及對照組中的水平

抗C-GPI435～453抗體在各組患者中的滴度分別為：RA組51.78±3.13、健康對照組33.27±2.72、OA組27.93±2.01、SLE組30.90±5.54、AS組22.65±3.10、痛風組23.87±4.16、其他結締組織病組24.32±1.72，各組間差異有統(tǒng)計學意義(單因素方差分析，F(xiàn)=7.592，P<0.001)。RA患者IgG型抗C-GPI435～453抗體滴度顯著高于健康對照組(33.27±2.72)和疾病對照組(27.06±1.80)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3)。而RA患者IgG型抗GPI435～453抗體滴度均值(55.50±3.77)與健康對照組(45.69±3.10)和疾病對照組(40.80±2.10)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖4)。

Abbreviations as in Figure 1. *P<0.05, vs. normal group or all of the disease control groups.

圖3 RA組、健康對照組及疾病對照組抗C-GPI抗體滴度(AU值)的比較

Figure3 Comparison of the titers (AU value)of anti-C-GPIantibody in RA patients, healthy controls and disease controls

2.3 抗C-GPI70～88抗體在RA診斷中的敏感性和特異性

抗C-GPI70～88抗體的ROC曲線下面積為 0.621，95%CI為0.564～0.677，臨界值為58.64，診斷敏感性為41.88%，特異性為84.50%，陽性預測值為80.00%，陰性預測值為49.55%，而抗GPI70～88抗體的ROC曲線下面積為0.465，無診斷意義。

Abbreviations as in Figure 1.

圖4 RA組、健康對照組及疾病對照組抗GPI抗體滴度(AU值)的比較

Figure4 Comparison of the titers (AU value)of anti-GPI antibody in RA patients, healthy controls and disease controls

2.4 抗C-GPI435～453抗體在RA診斷中的敏感性和特異性

抗C-GPI435～453抗體的ROC曲線下面積為0.654，95%CI為0.599～0.709，臨界值為41.78，診斷敏感性為46.05%，診斷特異性為86.05%，陽性預測值為83.02%，陰性預測值為51.87%，而抗GPI435～453抗體的ROC曲線下面積為0.569。

2.5 抗C-GPI70～88抗體和抗C-GPI435～453抗體并聯(lián)檢測的診斷意義

兩者并聯(lián)檢測在RA中的陽性率為50.79%，特異性為81.40%，陽性預測值為80.17%，陰性預測值為50.79%，抗C-GPI70～88抗體和抗C-GPI435～453抗體聯(lián)合檢測的敏感性有所提高，特異性略下降。

2.6 抗C-GPI70～88抗體和抗C-GPI435～453抗體對血清陰性RA的診斷價值

抗C-GPI70～88抗體和抗C-GPI435～453抗體在RF陰性RA患者(48例)中的陽性率分別為33.33%和37.50%，抗C-GPI70～88抗體和抗C-GPI435～453抗體在RF、AKA、CCP均陰性的RA患者(20例)中的陽性率分別為35.00%和45.00%。

2.7 抗C-GPI70～88抗體和抗C-GPI435～453抗體陽性組和陰性組的臨床及實驗室指標比較

抗C-GPI70～88抗體陽性RA患者80例、陰性111例，抗C-GPI435～453抗體陽性RA患者88例、陰性103例，將兩個抗體的陽性組與陰性組分別進行比較發(fā)現(xiàn)，陽性組較陰性組更加年輕(P<0.01)，但病程長短、DAS28-ESR評分、ESR、CRP、有無合并間質性肺炎、RF、AKA、CCP等指標在陽性組和陰性組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討論

GPI是一種多功能蛋白，在糖酵解和糖異生中發(fā)揮重要作用，并能促進細胞增殖和遷移，具有神經(jīng)營養(yǎng)和細胞因子的特性[3]。2001年Schaller等[4]的研究發(fā)現(xiàn)，64%的RA患者血清及關節(jié)液中IgG型抗GPI抗體和GPI抗原滴度升高，Cha等[5]的研究也發(fā)現(xiàn)RA患者關節(jié)液中存在大量的GPI抗體，表明GPI抗原及其抗體可能參與了RA的發(fā)病。然而關于GPI的研究結果并不一致，有研究顯示GPI及其抗體會加重RA關節(jié)炎癥[6]，也有報道認為GPI與病情活動度及骨侵蝕無明顯相關，且其陽性率不高[7]。目前關于C-GPI在RA中的作用研究較少，Umeda等[2]檢測了RA血清中7條抗C-GPI多肽抗體水平，發(fā)現(xiàn)其中的抗C-GPI70～88抗體和抗C-GPI435～453抗體在RA患者中陽性率和特異性均優(yōu)于抗GPI抗體，且與疾病活動度相關，提示C-GPI可能也參與了RA的發(fā)病。本研究在我國RA人群中檢測了血清中抗C-GPI70～88抗體和抗C-GPI435～453抗體及其原型肽抗體的水平，進而探討瓜氨酸化GPI在RA中的意義，結果發(fā)現(xiàn)抗C-GPI70～88抗體和抗C-GPI435～453抗體的滴度在RA組顯著高于其他各組，而未經(jīng)瓜氨酸修飾的原型肽抗體滴度在各組中差異無統(tǒng)計學意義，再次證實RA患者血清中可以檢測到抗C-GPI多肽抗體，提示C-GPI可能作為RA的自身抗原參與其發(fā)病過程。

關于GPI及其抗體在RA中的診斷價值，以往大多數(shù)研究結果表明GPI 抗原診斷RA的敏感性>65%，特異性≥90%，有較高的診斷價值[8-9]，而抗GPI抗體在RA診斷中的價值研究結果差異較大，診斷敏感性為4.5%～75.0%，特異性為64.3%～95.9%[10-15]。Umeda等[2]的研究發(fā)現(xiàn)，抗C-GPI70～88抗體和抗C-GPI435～453抗體在RA患者中的陽性率分別為25.5%和37%，對RA診斷的特異性高達98.1%～99.7%，可能是RA的診斷抗體。本研究評估了本組RA患者抗C-GPI70～88抗體和抗C-GPI435～453抗體的診斷價值，發(fā)現(xiàn)其敏感性分別為41.88%和46.05%，優(yōu)于Umeda等[2]的結果，但特異性卻下降，分別為84.50%和86.05%，造成這一差異的原因可能為：首先，納入的患者人種不同；其次，Umeda等[2]的研究中C-GPI70～88的3個精氨酸均被替換為瓜氨酸，而在本研究中C-GPI70～88的3個精氨酸只有前2個被替換為瓜氨酸，這一差別可能影響了抗體的敏感性和特異性；再次，我們測定的是瓜氨酸化多肽的抗體，而非蛋白，可能不能反映瓜氨酸化蛋白的所有表位，對敏感性和特異性也有一定影響?？傊?，鑒于本研究結果顯示其特異性不到90%，其是否可以作為RA診斷的特異性指標尚有待更多的研究驗證。

Umeda等[2]的研究還發(fā)現(xiàn)該抗體與疾病活動度相關，經(jīng)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)拮抗劑治療后，RA患者體內抗C-GPI多肽抗體滴度下降，但在本組RA患者中，抗C-GPI70～88抗體和抗C-GPI435～453抗體陽性組與陰性組臨床資料比較發(fā)現(xiàn)，DAS28-ESR評分、ESR、CRP、病程長短、間質性肺炎等指標兩組間差異無統(tǒng)計學意義，未能發(fā)現(xiàn)該抗體與疾病活動度的聯(lián)系。由于本研究未能比較抗體陽性RA患者治療前后的抗體水平變化，因此對于其與疾病活動度及預后的相關性尚有待進一步研究。

臨床上對于血清陰性RA患者的診斷缺少特異的實驗室指標，因此探索這些患者新的特異性診斷指標具有很大的臨床意義。本研究發(fā)現(xiàn)，抗C-GPI70～88抗體和抗C-GPI435～453抗體在血清陰性RA患者中的陽性率分別為35.00%和45.00%，可見其對血清陰性RA患者具有較高的診斷意義。

總之，本研究結果顯示C-GPI的確是RA的一種抗原，對于闡述RA的發(fā)病機制有一定意義。其在血清陰性RA患者中有一定的陽性率，可以為RA的診斷提供幫助。當然，本研究結果顯示其特異性低于90%，是否可作為特異性診斷指標尚需要更大樣本量的研究來證實。

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(2016-03-18收稿)

(本文編輯：趙 波)

Significance of antibodies to the citrullinated glucose-6-phosphate isomerase peptides in rheumatoid arthritis

WU Dong, SUN Lin, LI Chang-hong, YANG Lin, ZHAO Jin-xia△, LIU Xiang-yuan△

(Department of Rheumatology & Immunology, Peking University Third Hospital, Beijing 100191, China)

Objective： To detect the anti-citrullinated glucose-6-phosphate isomerase (GPI) 70-88 peptide antibody(anti-C-GPI70-88antibody),anti-citrullinated GPI 435-453 peptide antibody(anti-C-GPI435-453antibody), anti-GPI 70-88 peptide antibody(anti-GPI70-88antibody) and anti-GPI 435-453 peptide antibody(anti-GPI435-453antibody) in the serum of rheumatoid arthritis(RA) patients,and exa-mine the diagnostic values of the anti-C-GPI peptide antibodies in RA. Methods: The anti-C-GPI70-88antibody, anti-C-GPI435-453antibody, anti-GPI70-88antibody and anti-GPI435-453antibody were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) in 191 RA patients,129 other rheumatic diseases and 74 healthy controls. The clinical and laboratory data of the patients with RA were collected, and the values of anti-C-GPI peptide antibodies in the diagnosis of RA and the relationships of anti-C-GPI peptide antibodies with the clinical and laboratory parameters analyzed. Results: (1)The mean titers of the anti-C-GPI70-88antibody and the anti-C-GPI435-453antibody in the RA patients (respectively, 68.71±4.20 and 51.78±3.13) were significantly higher than those with other rheumatic diseases and healthy individuals(P<0.05). However,the mean titers of the anti-GPI70-88antibody and anti-GPI435-453antibody in the RA patients were similar to those with other rheumatic diseases and healthy individuals.(2)The diagnostic sensitivity and specificity of the anti-C-GPI70-88antibody for RA were 41.88% and 84.50% respectively; and the diagnostic sensitivity and specificity of the anti-C-GPI435-453antibody for RA were 46.05% and 86.05% respectively.The sensitivity of combined detection of the two anti-C-GPI peptide antibodies was 50.79%, and the specificity was 81.40%. (3) The positive rates of the anti-C-GPI70-88antibody and the anti-C-GPI435-453antibody were 35% and 45% respectively in those patients with negative anti-cyclic citrullinated peptide antibody, anti-keratin antibody, and rheumatoid factor. (4) There was no significant difference in clinical and laboratory indicators between the anti-C-GPI70-88antibody or anti-C-GPI435-453antibody positive group and negative group. Conclusion: The anti-C-GPI70-88antibody and anti-C-GPI435-453antibody can be detected in the serum of RA patients, and C-GPI may be involved in the pathogenesis of RA. There is a certain diagnostic significance for the sera-negative RA.

Arthritis, rheumatoid; Citrulline; Glucose-6-phosphate isomerase

國家自然科學基金(81571573)資助Supported by the National Natural Science Foundation of China (81571573)

時間：2016-11-2 9：03：46

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20161102.0903.020.html

R593.22

A

1671-167X(2016)06-0937-05

10.3969/j.issn.1671-167X.2016.06.003

△Corresponding author’s e-mail, zhao-jinxia@163.com, liu-xiangyuan@263.net