時小艷

(江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學院 醫(yī)藥與健康管理學院，江蘇淮安 223003)

血管生長調(diào)節(jié)因子與卵巢發(fā)育的關(guān)系

時小艷

(江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學院 醫(yī)藥與健康管理學院，江蘇淮安 223003)

旨在探討血管內(nèi)皮生長因子( VEGF-120)、促卵泡激素(FSH)、2-甲氧基雌二醇( 2-ME2)、4-羥基雌二醇(4-OHE2)對卵泡生成的影響。通過對比試驗，將試驗組分別腹腔注射上述 4 種藥品，一段時間后，HE染色統(tǒng)計分析卵巢中不同大小卵泡數(shù)量的變化、卵泡周圍血管發(fā)育情況及定量分析VEGF、FLK-1表達情況。結(jié)果表明，VEGF-120組和FSH組大卵泡數(shù)增加，血管發(fā)育良好，VEGF和FLK-1基因表達增加； 2-ME2 和4-OHE2組大卵泡數(shù)減少，血管發(fā)育情況較差。綜合分析發(fā)現(xiàn)，血管簇發(fā)育良好的卵泡生長狀態(tài)良好，卵泡的生長與血管的發(fā)育存在一定關(guān)聯(lián)。

卵泡生長；血管發(fā)育；調(diào)節(jié)因子

卵泡的發(fā)育與血管是密切相關(guān)的，每個卵泡可以獨立調(diào)節(jié)血管的生長。小卵泡周圍沒有血管。隨著卵泡直徑的增長，卵泡周圍的血管分支逐漸增多，用來供給卵泡發(fā)育足夠的養(yǎng)分。通過更高級的血管網(wǎng)提供優(yōu)先養(yǎng)分對優(yōu)勢卵泡發(fā)育十分重要。血管內(nèi)皮細胞減少能夠?qū)е侣雅蓊w粒細胞凋亡，進而導致卵泡閉鎖。卵泡閉鎖在卵泡發(fā)育的早期啟動，并且貫穿于整個卵泡發(fā)育過程[1-2]。在排卵前，始基卵泡及原始卵泡主要依靠間質(zhì)血管供血，血管網(wǎng)不存在。原始卵泡開始發(fā)育后，微血管出現(xiàn)在卵泡膜層，隨著原始卵泡發(fā)育為竇前卵泡，進一步發(fā)育為竇狀卵泡，微血管的密度也同步增加，對卵泡發(fā)育具有重要作用[3-4]。在卵泡發(fā)育過程中，血管生成持續(xù)進行，最終形成巨大的微血管網(wǎng)，但是都分布在卵泡膜層，并未突破基膜進入顆粒細胞層。在血管發(fā)育過程中，一些因子能調(diào)節(jié)血管的發(fā)育，本文通過小鼠腹腔注射VEGF-120、FSH、 2-ME2、 4-OHE2等因子，以期揭示卵泡的發(fā)育與血管生長的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動物來源

2周齡雌性昆明白鼠(12～16 g)及 6 周齡雌性昆明白鼠(17～20 g)均購自南京市青龍山動物繁殖中心。飼養(yǎng)在溫度24～26 ℃、光控14 h(光)/10 h(暗)的條件下，自由采食飲水。

1.2 主要試劑和儀器

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF-120)、促卵泡激素(FSH)、2-甲氧基雌二醇(2-ME2)、4-羥基雌二醇(4-OHE2)均購自美國Sigma公司，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(美國Promega公司)，TaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)，SYBR PremixTaqTM熒光定量酶、Trizol(Invitrogen公司)，蘇木素液、伊紅染液等。主要器械為動物稱量稱、注射器、手術(shù)板、手術(shù)器械等，均產(chǎn)自中國。電泳儀，北京六一產(chǎn)品；定量PCR儀，美國ABI公司產(chǎn)品。

1.3 卵巢組織切片

將孕鼠用頸椎脫臼法致死，解剖取出卵巢，然后將整個卵巢組織樣固定-脫水-透明-浸蠟-包埋-修整-切片。

1.4 卵泡計數(shù)

卵泡按顯微鏡下測量的尺寸大小分為大中小 3 類，其中大卵泡 50～150 μm，中卵泡150～250 μm，大卵泡>250 μm。卵泡計數(shù)以卵母細胞核作為標記物，連續(xù) 6 μm切片，每隔5 張切片計數(shù)。按照上述方法，計數(shù)每個卵巢中的各類卵泡。

1.5 發(fā)情鑒定

為避免小鼠排卵對卵泡數(shù)目的影響，對性成熟的小鼠(6周齡)統(tǒng)一進行發(fā)情周期的判定，與發(fā)情后期開始注射VEGF-120、FSH、 2-ME2、 4-OHE2等因子，并與發(fā)情前將卵巢固定，采用陰道涂片法進行發(fā)情鑒定。

陰道涂片法：每天7:00-8:00檢查。以左手拇指和食指捏住小鼠尾巴，將小鼠放在鐵絲蓋上，當其前爪抓住鐵絲網(wǎng)時，提起尾巴，抖掉毛上粘的鋸末及贓物，如糞便等，再用其余3指輕壓其后腰背部，翻起尾巴露出陰道口，然后右手持滴管吸少量生理鹽水入陰道口，要盡量不讓滴管觸及陰道口，以免檢查多次引發(fā)炎癥。當稍放松尾部及腰部時，生理鹽水即被吸人陰道，稍后3指輕壓腰部，黏液隨生理鹽水流出，吸人滴管中，滴到載玻片上，稍干燥用甲醇固定5 min，然后用姬姆薩染液染色15 min，隨即沖片、干燥、鏡檢，分別表示發(fā)情前期、發(fā)情中期、發(fā)情后期和發(fā)情間期陰道涂片細胞特點。發(fā)情前期圓形有核上皮細胞占優(yōu)勢，少量白細胞，有時混有少量無核的角化上皮細胞；發(fā)情中期幾乎全為無核角化上皮細胞，細胞大而扁平，邊緣不整齊；發(fā)情后期大量的角化上皮細胞，常聚集成堆，出現(xiàn)許多白細胞及有核上皮細胞；發(fā)情間期大量散在的白細胞，有時混有少量圓形有核上皮細胞(圖1)。

1.6 注射處理

采用完全隨機分組方法，將動物隨機分為 5 組，每組5只。對照組、VEGF-120組、FSH組、 2-ME2組、 4-OH2組。對于小鼠需進行發(fā)情周期的判斷，在小鼠發(fā)情后期開始腹腔注射藥品，于情期前處死小鼠。其中FSH組每隔12 h注射1次，連續(xù)注射2 d。其他組每隔24 h注射1次，連續(xù)注射3 d。

A.發(fā)情前期 Early stage of oestrus; B.發(fā)情中期 Middle of oestrus; C.發(fā)情后期 Llate oestrus; D.發(fā)情間期 Interphase of the oestrus

1.7 墨水注射法

為了能更好地觀察紅細胞分布情況，來分析血管的發(fā)育狀況，試驗采用墨水注射法分析血管的分布。將小鼠左側(cè)靜脈斷開，從右側(cè)靜脈注射納米碳素墨水，直至小鼠尾巴變?yōu)楹谏珪r停止注射，以便墨水進入全身各處血管。隨后取小鼠卵巢做切片，HE染色觀察卵泡周圍血管的分布情況。結(jié)果顯示，切片中紅細胞所在的位置與墨水進入的地方相吻合。統(tǒng)計卵泡周圍紅細胞的數(shù)目，并由此來確定血管的發(fā)育情況，紅細胞數(shù)目越多表示血管發(fā)育越好。

1.8 引物設(shè)計和熒光實時定量PCR

參照GenBank中β-actin、VEGF、Flk-1mRNA基因序列，應(yīng)用Oligo 6分子生物學軟件，設(shè)計 3 對特異性引物(表1)。引物由英俊生物技術(shù)有限公司合成。實時定量PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性1 min；46個循環(huán)：95 ℃ 10 s，59 ℃退火10 s，72 ℃ 15 s； 72 ℃延伸 5 min。

表1 實時定量PCR所用引物

1.9 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計學軟件，選用One-Way ANOVA分析，數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組處理對卵巢質(zhì)量的影響

與對照相比，性成熟小鼠(圖2)注射FSH和VEGF-120后小鼠卵巢質(zhì)量顯著增加(P<0.05)， 2-ME2和4-OHE2對卵巢質(zhì)量作用不明顯；FSH注射組與VEGF-120注射組差異不顯著； 2-ME2注射組與 4-OH2注射組差異不顯著；FSH 注射組和VEGF-120注射組都與 2-ME2注射組和4-OH2注射組差異顯著(P<0.05)。

不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05),下圖同 Different lowercase letters represent significant difference under different treatments at P<0.05，The same as below.

2.1.1 卵巢中大卵泡(大于250 μm)的數(shù)量變化 由圖3可知，注射FSH和VEGF-120對卵泡數(shù)目明顯上升(P<0.05)，而其他試驗組不顯著。FSH注射組與VEGF-120注射組差異不顯著； 2-ME2注射組與4-OH2注射組差異不顯著；FSH 注射組和VEGF-120注射組都與 2-ME2注射組和 4-OH2注射組差異顯著(P<0.05)；圖4為大卵泡的HE染色切片圖，箭頭指示的是大卵泡所在的位置,可觀察到卵泡已經(jīng)有明顯的卵泡腔。

圖3 不同處理小鼠的大卵泡數(shù)

圖4 大卵泡HE切片

2.1.2 卵巢中中卵泡(150～250 μm)的數(shù)量變化 如圖5所示，與對照組相比注射 2-ME2組中卵泡數(shù)目顯著下降(P<0.05)，VEGF-120組中卵泡數(shù)目顯著上升(P<0.05)；FSH組和VEGF-120組差異不顯著； 2-ME2組與4-OH2組差異顯著(P<0.05)；圖6為中卵泡HE切片染色圖，箭頭指示的是中卵泡所在的位置,可以看出中卵泡的卵泡腔還未發(fā)育完全，顆粒細胞層達到 6～8層。

2.1.3 卵巢中小卵泡(50～150 μm)的數(shù)量變化 如圖7所示，與對照組相比注射VEGF-120組小卵泡數(shù)量下降，其他組不顯著；FSH組和VEGF-120組差異顯著(P<0.05)； 2-ME2注射組與 4-OH2注射組差異不顯著；FSH組與 2-ME2組和4-OH2組差異不顯著，VEGF-120組顯著低于 2-ME2組和4-OH2組(P<0.05)；圖8為小卵泡HE切片圖，箭頭指示的是小卵泡所在的位置,可以看出小卵泡的顆粒細胞層為2～3層。

圖5 不同處理小鼠的中卵泡數(shù)

圖6 中卵泡HE切片

2.2 不同處理對卵巢卵泡周圍血管發(fā)育的影響

2.2.1 大卵泡(大于250 μm)周圍紅細胞數(shù)量 如圖9所示， 6周齡小鼠注射FSH、VEGF-120后大卵泡周圍的紅細胞數(shù)相對于對照組顯著上升(P<0.05)，而注射 2-ME2、4-OH2后大卵泡周圍的紅細胞數(shù)相對于對照組顯著下降(P<0.05)；FSH注射組和VEGF-120注射組大卵泡周圍紅細胞差異不顯著； 2-ME2注射組與4-OH2注射組大卵泡周圍血管差異不顯著；FSH注射組和VEGF-120注射組對于大卵泡周圍血管相對于4-OH2和 2-ME2注射組顯著上升(P<0.05)。

圖7 不同處理小鼠的小卵泡數(shù)

圖8 小卵泡HE切片

圖9 不同處理小鼠的中卵泡血管

2.2.2 中卵泡(150～250 μm)周圍紅細胞數(shù)量 如圖10所示，6周齡小鼠注射藥品FSH和VEGF-120后中卵泡周圍紅細胞數(shù)目上升，注射藥品 2-ME2后中卵泡周圍紅細胞數(shù)目明顯下降，而其他試驗組作用不明顯。FSH注射組和VEGF-120注射組中卵泡周圍紅細胞差異不顯著； 2-ME2注射組對于中卵泡周圍血管相對于 4-OH2注射組顯著下降；FSH注射組和VEGF-120注射組對于中卵泡周圍血管相對于 2-ME2注射組顯著上升(P<0.05)，F(xiàn)SH注射組和VEGF-120注射組對于中卵泡周圍血管相對于4-OH2注射組顯著上升(P<0.05) 。

2.2.3 小卵泡(50～150 μm)周圍紅細胞數(shù)量 如圖11所示，6周齡小鼠注射藥品 2-ME2后小卵泡周圍紅細胞數(shù)目減少，其他試驗組作用不明顯。FSH注射組和VEGF-120注射組中卵泡周圍紅細胞差異不顯著； 2-ME2注射組對于中卵泡周圍血管相對于4-OH2注射組顯著下降；FSH注射組和VEGF-120注射組對于中卵泡周圍血管相對于 2-ME2注射組顯著上升(P<0.05)，F(xiàn)SH注射組和VEGF-120注射組對于中卵泡周圍血管相對于4-OH2注射組差異不顯著。

圖10 不同處理小鼠的小卵泡血管

圖11 VEGF和 FLK-1在顆粒細胞表達情況

2.3 卵巢顆粒細胞中相關(guān)基因表達量的變化

2.3.1VEGF和FLK-1在顆粒細胞中表達情況 如圖12、圖13所示，VEGF和FLK-1均在顆粒細胞中表達。

圖12 電泳圖

2.3.2VEGF表達量 如圖13所示，注射VEGF-120后6周齡小鼠顆粒細胞中VEGF表達量明顯上升(P<0.05)，4-OH2組的表達量顯著下降，其他試驗組作用不明顯；FSH注射組比VEGF-120注射組表達量顯著下降； 2-ME2注射組和4-OH2注射組差異不顯著；FSH注射組相對于 2-ME2注射組和4-OH2注射組顯著上升，VEGF-120注射組相對于 2-ME2注射組和4-OH2注射組顯著上升。

2.3.3FLK-1表達量 如圖14所示，注射FSH和VEGF-120后六周齡小鼠顆粒細胞中FLK-1表達量明顯上升(P<0.05)，其他試驗組作用不明顯。FSH注射組和VEGF-120注射組表達量差異不顯著； 2-ME2注射組和4-OH2注射組差異不顯著；FSH注射組和VEGF-120注射組相對于 2-ME2注射組和4-OH2注射組顯著上升。

圖13 VEGF在不同處理小鼠顆粒細胞中的表達

圖14 FLK-1在不同處理小鼠顆粒細胞中的表達

Fig.14FLK-1level in granulocyte of different treatment

3 討 論

本文主要探討小鼠腹腔注射PBS、FSH、2-ME2、 4-OH2、VEGF-120等試劑后，對小鼠卵泡發(fā)育和血管生長的影響，來研究小鼠卵泡和血管發(fā)育是否存在一定的聯(lián)系。

FSH 在雌性動物可促進子宮內(nèi)膜生長、排卵、刺激多卵泡育等。在自然條件下，單胎動物只有一個卵泡發(fā)育成熟至排卵，即使多胎動物也只有部分卵泡發(fā)育成熟，其他卵泡在不同發(fā)育階段先后退化，可見正常垂體分泌的FSH 只能保證1個或部分卵泡發(fā)育成熟。如果在發(fā)情前期給動物注射大量FSH，就能使將要退化的卵泡發(fā)育成熟，其排卵量可超過正常排卵數(shù)的若干倍[5]。在本試驗中注射FSH組的大卵泡數(shù)高于其他組，并且血管數(shù)高于對照組，卵泡閉鎖率卻低于其他組。FSH可能通過其與受體間的相互作用增加IGF-1和類固醇水平，從而抑制顆粒細胞的凋亡。有些研究顯示，對于發(fā)情周期的小鼠卵巢FSH受體在卵泡成熟過程中FSHR表達水平會增加，排卵后迅速下降，在閉鎖卵泡及發(fā)生凋亡的顆粒細胞中，卵巢FSHR水平明顯降低。對于FSH能促進血管發(fā)育，可能是FSH在促進卵泡發(fā)育的同時，能調(diào)節(jié)一些血管發(fā)育因子的表達，使得血管發(fā)育良好，從而為卵泡的發(fā)育奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

2-ME2在抗腫瘤的研究比較頻繁，細胞凋亡的途徑通常有2條：通過細胞外信號激活細胞內(nèi)的凋亡蛋白酶；細胞應(yīng)急反應(yīng)或者凋亡信號首先引起線粒體細胞色素C的釋放，其余一些凋亡蛋白因子形成凋亡酶復(fù)活物，激活Caspase-3,進而引發(fā)Caspase級聯(lián)反應(yīng)，活化Caspase可將細胞內(nèi)的重要蛋白降解，導致細胞凋亡。2-ME主要通過細胞死亡受體途徑和線粒體途徑導致細胞凋亡。近幾年2-ME2在抑制血管發(fā)育也有所被了解。2-ME2 可下調(diào)低氧誘導因子(HIF-1) 轉(zhuǎn)錄后水平蛋白表達, 從而抑制低氧誘導因子(HIF-1) 誘導的VEGF表達。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是公認的最重要的靶器官上的促血管增生因子。低氧誘導因子1 (HIF-1) 作為核心轉(zhuǎn)錄因子和低氧反應(yīng)應(yīng)答的共同路徑，可能調(diào)控低氧時VEGF的轉(zhuǎn)錄表達[6-7]。 2-ME2促進細胞凋亡和抑制血管發(fā)育并不是獨立的。其在抑制血管作用同時也會促進一些凋亡因子的活化。在本試驗中注射2-ME2組的小鼠卵泡周圍的血管發(fā)育比較差，并且卵泡的閉鎖率也相對于其他幾組較高，可能由于卵泡的發(fā)育需要血液運輸來提供其養(yǎng)分， 2-ME2抑制血管的發(fā)育，使得卵泡周圍血管減少，卵泡得不到充足的養(yǎng)分顆粒細胞發(fā)育受到了抑制隨即發(fā)生了凋亡；從分子機制來講可能是 2-ME2在阻斷VEGF的激活的同時，一些通路也激活，比如AKT信號轉(zhuǎn)導通路導致JNK活化，并間接阻斷P53等。通過本試驗的研究表明， 4-OH2能抑制血管的發(fā)育，但是相對于2-ME2來說，4-OH2抑制能力要弱一些，并且4-OH2也能促進卵泡的凋亡。

VEGF作為血管形成最關(guān)鍵的因子，其能促進血管內(nèi)皮細胞增值，增加血管通透性來達到促進血管發(fā)育的作用[8-9]。FLK-1和FIT-1是VEGF的主要功能受體，它們僅存在于血管內(nèi)皮細胞中。它們與VEGF結(jié)合后有明顯的VEGF依賴性Ca2+外流，但是其激活后效果有所不同：FLK-1激活后可引起內(nèi)皮細胞分裂，遷移；而FIT-1激活后無明顯促有絲分裂作用，該受體作用可能與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞與基底膜作用有關(guān)。本試驗中注射VEGF-120組的小鼠大中卵泡周圍的血管發(fā)育比其他組要良好，其不僅可以增加自身的VEGF基因表達，還可以增加FLK-1血管生成的受體基因表達。由于小卵泡周圍血管很少，這樣的小卵泡對VEGF的敏感性可能比較低。由于注射VEGF-120組的大中卵泡血管發(fā)育良好，這樣給以卵泡的營養(yǎng)物質(zhì)是比較充足的，所以VEGF-120組的卵泡發(fā)育隨之也是良好的。

有研究表明卵泡的血管發(fā)育對于排卵前的卵泡發(fā)育是起著十分重要的作用的，VEGF在卵泡血管形成的不同時期起著不同的作用[10-11]。通過本試驗的研究卵泡和血管的發(fā)育肯定存在這相互促進或者相互抑制的作用。

綜上所述，卵泡周圍毛細血管新生對卵泡的生長發(fā)育過程有重要的影響，許多細胞因子通過促進血管新生來增強血管通透性，為卵泡的發(fā)育提供更多的氧氣、激素和營養(yǎng)物質(zhì)?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)越來越多的細胞因子參與血管新生的調(diào)控，但細胞因子間的相互作用機理還有待于進一步探索。隨著對血管新生機制和細胞因子間信號傳導研究的深入，以期對卵泡發(fā)育進行有效的調(diào)控，從而提高卵子質(zhì)量。

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Received 2014-12-24 Returned 2015-06-18

Foundation item National Key Basic Research and Development Program (973 Program) (No.2007CB947403).

About author SHI Xiaoyan,female,master student,lecturer.Research area:animal genetic.E-mail:jumplianxin@163.com

(責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Relation of Vascular Endothelial Growth Factor and Ovarian Development

SHI Xiaoyan

(Department of Medicine and Health Management，Jiangsu Food Science College， Huai’an Jiangsu 223003，China)

To investigate effects of vascular endothelial growth factor (VEGF-120),follicle stimulating hormone (FSH), 2-methoxy estradiol ( 2-ME2), estradiol 4-hydroxy(4-OHE2) on folliculogenesis. By contrast test, these 4 kinds of drugs were injected intraperitoneally in the test group .After a period of time, HE staining was analyzed statistically in the number change of different sizes ovarian, expression changes of the vascular and quantitative development ofVEGF,FLK-1.The results showed that the number of large follicles in groupVEGFand group FSH increased, the expression ofVEGFandFLK-1genes increased, the number of large follicles in 2-ME2 and 4-OHE2 groups decreased, and the vascular development was poor. The conclusion was that follicular with good cluster grew well ,follicular growth had a certain correlation with the development of blood vessels.

Follicular growth; Vascular development; Regulation factor

2014-12-24

2015-06-18

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(“973”計劃)(2007CB947403)。

時小艷，女，講師，碩士研究生，研究方向為動物遺傳育種。E-mail：jumplianxin@163.com

日期：2016-12-12

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161212.1114.004.html

Q38

A

1004-1389(2016)12-1755-07