周蘊薇，劉 彧，馬 欣，高文杰，何 淼

(東北林業(yè)大學 園林學院，哈爾濱 150040)

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)地被菊‘紫妍’遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

周蘊薇，劉 彧，馬 欣，高文杰，何 淼

(東北林業(yè)大學 園林學院，哈爾濱 150040)

以地被菊‘紫妍’高效再生體系為基礎(chǔ)，研究農(nóng)桿菌介導(dǎo)的地被菊‘紫妍’遺傳轉(zhuǎn)化的若干影響因素。結(jié)果表明：卡那霉素6、4 mg·L-1分別是葉片分化和植株生根的最適篩選質(zhì)量濃度，同時確定羧芐霉素200 mg·L-1是抑制農(nóng)桿菌生長的最適質(zhì)量濃度；預(yù)培養(yǎng)2 d，侵染時菌液OD600約為0.5，侵染時間8 min，共培養(yǎng)2 d，延遲培養(yǎng)3 d有利于提高轉(zhuǎn)化頻率。對抗性芽進行生根篩選后，抗性苗提取DNA經(jīng)過PCR檢測初步證明外源基因ClCBF4已整合到地被菊中。移栽出的轉(zhuǎn)基因地被菊全部存活且生長狀況良好。

地被菊；遺傳轉(zhuǎn)化；根癌農(nóng)桿菌；ClCBF4

地被菊(Chrysanthemumgrandiflorum)是菊花中具有植株低矮、抗逆性強、管理粗放和花緊密等特點的一個品種群[1]。由于其盛花期在“十一”前后，這一新型菊花已在很多地區(qū)得到推廣和應(yīng)用[2]。但是，這種新型菊花在中國北方應(yīng)用受到的一個限制性因素就是在秋冬季露地生長情況下綠期較短[3]。因此，開展培育耐寒性較強的品種并加以應(yīng)用顯得尤為重要。

CBF(C-repeat bing factor)是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在逆境條件下，CBF轉(zhuǎn)錄因子能激活下游含有CRT/DRE(C-repeat dehydration-responsive element)順式作用元件的COR(cold-regulated)基因的表達，從而提高植物的抗逆性[4]。當植物細胞感應(yīng)到干旱、高鹽或低溫等脅迫的時候，一系列CBF上游轉(zhuǎn)錄因子被激活，同時CBF基因表達產(chǎn)物與下游一系列COR基因啟動子中的CRT/DRE元件結(jié)合[5]，誘導(dǎo)大量抗性基因表達，以增強植物綜合抗逆性。這類轉(zhuǎn)錄因子一般存在于干早、高鹽或低溫脅迫條件下應(yīng)答基因的啟動子中，刺激這類抗性基因的表達來提高植物的抗逆性[6-8]。在前期表達分析中發(fā)現(xiàn)，該基因在甘菊中不但受冷誘導(dǎo)表達，同時受到鹽、干旱的誘導(dǎo)表達[9]。目前，已經(jīng)在多種植物上得到證實和應(yīng)用，如肖政等[10]成功將CBF1基因轉(zhuǎn)入菊花“小金黃”。

本研究擬將抗性因子轉(zhuǎn)入地被菊中以提高抗逆性，使其具有更長的花期，在綠化過程中發(fā)揮更加重要的作用。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將甘菊ClCBF4基因轉(zhuǎn)入地被菊中，旨在獲得具有優(yōu)良穩(wěn)定性的轉(zhuǎn)基因植株。了解非模式植物中抗性因子的作用，同時獲得具有更強抗逆性的地被菊品種，以期為今后開展抗性強的地被菊品種培育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

將培養(yǎng)20 d左右的地被菊‘紫妍’完全展開的無菌上部葉片作為外植體，切成0.5 cm×0.5 cm小葉片作為受體材料。

農(nóng)桿菌菌株是GV3101，攜帶有35S啟動子的自野生甘菊中克隆出的ClCBF4轉(zhuǎn)錄因子，其表達載體是pBI121，2012年于北京林業(yè)大學園林學院戴思蘭教授實驗室構(gòu)建，置于東北林業(yè)大學園林學院實驗室保存。

卡那霉素(Km)、羧芐青霉素(Carb)、利福平(Rif)、慶大霉素(Gent)酵母粉、胰蛋白胨、MS培養(yǎng)基、6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)等藥品購于哈爾濱伊事達生物公司。植物基因組DNA提取試劑盒為天根植物基因組DNA提取系統(tǒng)。

1.2 遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的方法

農(nóng)桿菌的活化培養(yǎng)參照向太和等[11]的方法。

卡那霉素對地被菊‘紫妍’葉盤的篩選質(zhì)量濃度、卡那霉素抑制莖段生根的最佳質(zhì)量濃度、羧芐霉素對葉片脫菌質(zhì)量濃度的確定參照儲俊等[12]的方法。預(yù)培養(yǎng)時間、農(nóng)桿菌侵染時間、共培養(yǎng)時間、延遲培養(yǎng)時間的確定參照Sun等[13]的方法。

預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基：MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1。

最適生根培養(yǎng)基：MS+NAA 0.2 mg·L-1。

延遲篩選培養(yǎng)基：MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+Carb 300 mg·L-1。

分化篩選培養(yǎng)基：MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+Km 6 mg·L-1+Carb 200 mg·L-1。

生根篩選培養(yǎng)基：1/2MS+NAA 0.2 mg·L-1+Km 4 mg·L-1。

1.3 轉(zhuǎn)基因植株的篩選及鑒定

將‘紫妍’經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化后的再生苗從葉盤外植體上取下后，接入生根篩選培養(yǎng)基中，篩選出的生根植株通過試劑盒提取基因組DNA，提取的植株部位為抗性苗葉片。

以提取好的抗性苗DNA為模板，未轉(zhuǎn)化的野生型植株做陰性對照，水作為空白對照，pBI121-ClCBF4質(zhì)粒為陽性對照，CBF4-BamHⅠ:5′-CGCGGATCCTTTACAAGTCCAAA- ACAACT-3′為上引物，CBF4-ScaⅠ:5′-TTTAGTACTATAACTCCATAGCGCCAC-3′為下引物，進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物于10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。擴增體系為：1 μL DNA模板，1 μL CBF4-BamHⅠ，1 μL CBF4-ScaⅠ，10 μL 2×EasyTaqPCR SuperMix，7 μL ddH2O。擴增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s；57 ℃退火50 s；72 ℃延伸40 s；72 ℃延伸10 min；10 ℃終止；4 ℃保存，25個循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 卡那霉素對葉片分化率的影響

在葉片最適分化培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的卡那霉素顯著地影響地被菊‘紫妍’的葉片分化率，由表1可以看出，當卡那霉素質(zhì)量濃度由0 mg·L-1增至4 mg·L-1時，葉片分化率逐漸降低，且降幅較大，而當卡那霉素質(zhì)量濃度大于4 mg·L-1時，葉片分化率降至0。同時，在試驗期間觀察到，當卡那霉素質(zhì)量濃度在0、2、4 mg·L-1時，葉片逐漸增大，愈傷組織形成明顯，而隨著卡那霉素質(zhì)量濃度增大，葉片愈傷形成不明顯，甚至黃化、褐化死亡(圖1)。所以選取6 mg·L-1作為葉片的最適篩選質(zhì)量濃度。

表1 不同質(zhì)量濃度卡那霉素條件下葉片分化情況

2.2 卡那霉素對植株生根的影響

卡那霉素質(zhì)量濃度對植株生根情況有著較大的影響。由表2可以看出，隨著卡那霉素質(zhì)量濃度的增加，生根系數(shù)和平均根長顯著減小(P<0.05)，當卡那霉素質(zhì)量濃度增至4 mg·L-1時，生根率、生根系數(shù)、平均根長均降至0。同時，在試驗過程中觀察到，隨著卡那霉素質(zhì)量濃度的增加，植株逐漸低矮，葉片變小、發(fā)黃甚至萎蔫；植株中下段莖部發(fā)生紫化現(xiàn)象，且逐漸明顯，根部呈現(xiàn)褐色突起，阻礙植株生根和地上部分生長，一段時間后導(dǎo)致植株死亡(圖2)。所以選取4 mg·L-1作為植株生根的最適篩選質(zhì)量濃度。

2.3 不同質(zhì)量濃度羧芐青霉素對葉片脫菌的影響

羧芐青霉素是常用的轉(zhuǎn)基因試驗抑菌劑，加入適量的羧芐霉素既能抑制侵染后多余菌液的擴大生長，又能使葉片分化受到最小的影響。如表3所示，當羧芐毒霉素質(zhì)量濃度為100 mg·L-1時，有近一半的葉片被菌液污染邊緣，導(dǎo)致分化率較低，而當羧芐毒霉素質(zhì)量濃度為200、300 mg·L-1時，菌落生長受到抑制，葉片分化率升高且差異不顯著(P>0.05)，而羧芐毒霉素質(zhì)量濃度再增大時，菌落生長雖被完全抑制，但葉片分化率顯著降低(P<0.05)，所以從葉片分化率、菌落生長情況和預(yù)防浪費多角度分析，選取羧芐毒霉素 200 mg·L-1作為抑制農(nóng)桿菌生長的最適質(zhì)量濃度。在延遲培養(yǎng)之后的培養(yǎng)過程中，通過觀察葉片分化和菌落生長情況，適量減小羧芐毒霉素的質(zhì)量濃度，達到抑菌作用后即可停止使用。

A～I分別表示卡那霉素質(zhì)量濃度為0、2、4、6、8、10、15、20、30 mg·L-1時葉片分化情況。

表2 不同質(zhì)量濃度卡那霉素條件下植株生根情況

2.4 預(yù)培養(yǎng)時間的確定

葉片在侵染前要經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)階段，目的是使葉片細胞在侵染時處于較高的分化狀態(tài)，適當?shù)念A(yù)培養(yǎng)時間能夠提高葉片轉(zhuǎn)化率。如表4所示，葉片不經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)階段直接進行侵染時，抗性愈傷生成率較低，且沒有抗性芽生成；預(yù)培養(yǎng)2 d時的抗性芽生成率顯著高于預(yù)培養(yǎng)1、3 d時(P<0.05)，說明預(yù)培養(yǎng)時間過長，葉片傷口逐漸愈合，對菌液的侵染產(chǎn)生抵御能力，不利于轉(zhuǎn)化。所以選擇2 d作為最適預(yù)培養(yǎng)時間。

1～9分別表示卡那霉素質(zhì)量濃度為0、2、4、6、8、10、15、20、30 mg·L-1 時植株生根情況。

表3 不同質(zhì)量濃度羧芐青霉素條件下葉片分化情況

表4 不同預(yù)培養(yǎng)時間下的轉(zhuǎn)化情況

注：農(nóng)桿菌菌液OD600=0.5，侵染時間8 min，共培養(yǎng)2 d，延遲培養(yǎng)3 d。

Note:BacteriumOD600=0.5, infected for 8 min, co-cultured for 2 d, delaye-cultured for 3 d.

2.5 侵染時間的確定

農(nóng)桿菌侵染葉片時一般情況下選擇菌液OD600約為0.5～0.6，此時農(nóng)桿菌活性最強，最適宜侵染。所以在此基礎(chǔ)上設(shè)置不同的侵染時間，如表5所示，侵染時間為8、10 min時抗性愈傷生成率較高，顯著高于其他處理(P<0.05)，而侵染8 min時的抗性芽生成率最高，顯著高于其他處理(P<0.05)，同時在試驗過程中觀察發(fā)現(xiàn)，侵染時間較短，不利于菌液附著在葉片上，使得菌液對于葉盤的侵蝕作用不明顯；而侵染時間過長時，菌液極有可能會大面積侵蝕葉片，使得在接下來的培養(yǎng)中產(chǎn)生葉片軟腐現(xiàn)象，難以形成抗性愈傷和抗性芽。所以選擇8 min作為最適侵染時間。

表5 不同侵染時間下的轉(zhuǎn)化情況

注：農(nóng)桿菌菌液OD600=0.5，預(yù)培養(yǎng)2 d，共培養(yǎng)2 d，延遲培養(yǎng)3 d。

Note: BacteriumOD600=0.5, pre-cultured for 2d, co-cultured for 2d, delaye-cultured for 3 d.

2.6 共培養(yǎng)時間的確定

試驗結(jié)果表明，共培養(yǎng)1 d時，抗性愈傷生成率較低，并且沒有抗性芽生成(表6)，說明菌液并沒有有效地侵染葉片；共培養(yǎng)2 d時，抗性愈傷和抗性芽都顯著高于其他處理(P<0.05)。同時，試驗過程中發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)1 d時很難觀察到菌落的形成，葉片幾乎沒有變化，而隨著共培養(yǎng)時間的增加，能明顯觀察到菌落開始附著在葉片上，但4 d 時葉片已經(jīng)受到嚴重侵蝕，葉片難以繼續(xù)培養(yǎng)。所以選擇2 d作為最適共培養(yǎng)時間。

表6 不同共培養(yǎng)時間下的轉(zhuǎn)化情況

注：農(nóng)桿菌菌液OD600=0.5，預(yù)培養(yǎng)2 d，侵染時間8 min，延遲培養(yǎng)3 d。

Note:BacteriumOD600=0.5, pre-cultured for 2 d, infected for 8 min, delaye-cultured for 3 d.

2.7 延遲培養(yǎng)時間的確定

延遲培養(yǎng)是經(jīng)過共培養(yǎng)之后的葉片不直接加入選擇壓(即卡那霉素)，只是先進行脫菌培養(yǎng)，一段時間后再加入選擇壓，既有利于轉(zhuǎn)化細胞的生長，又不會產(chǎn)生較多嵌合體。延遲培養(yǎng)是必不可少的過程，若不經(jīng)過延遲培養(yǎng)而直接篩選葉片，容易將已轉(zhuǎn)化的細胞直接篩死，增加轉(zhuǎn)化難度。由表7可以看出，隨著延遲培養(yǎng)時間的增加，愈傷生成率逐漸增加，但抗性芽生成率是先升高后降低，在3 d時達到最大值，與其他處理差異顯著(P<0.05)。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，雖然延遲培養(yǎng)4 d時，愈傷組織形成率比較高，但由于延遲培養(yǎng)時間過長，導(dǎo)致未轉(zhuǎn)化細胞長勢強，假陽性苗增多，一段時間篩選后假陽性苗逐漸白化篩死，增加了篩選工作量。所以選擇3 d作為最適延遲培養(yǎng)時間?！暗乇痪铡襄剐杂鷤涂剐匝恳妶D3”。

表7 不同延遲培養(yǎng)時間下的轉(zhuǎn)化情況

注：農(nóng)桿菌菌液OD600=0.5，預(yù)培養(yǎng)2 d，侵染時間8 min，共培養(yǎng)2 d。

Note:BacteriumOD600=0.5, pre-culture 2 d, infecting time 8 min, co-culture 2 d.

抗性愈傷組織(A)；抗性芽(B) The resistant callus (A); The resistant shoots (B)

2.8 抗性植株的獲得及鑒定

將篩選出的抗性苗轉(zhuǎn)到含4 mg·L-1卡那霉素的生根培養(yǎng)基中進一步篩選(圖4)，淘汰不能生根的假陽性苗，植株經(jīng)過篩選后，假陽性苗沒有生根且莖葉黃化死亡，最終獲得轉(zhuǎn)基因苗11株，分別編號為1～11，提取轉(zhuǎn)基因苗葉片基因組DNA，以其為模板，用ClCBF4基因特異性引物進行PCR檢測后，將擴增產(chǎn)物在10 g/L的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。分析表明，其中有10株抗性苗在642 bp處擴增出與陽性對照相同長度的基因特異片段，而空白對照和未轉(zhuǎn)基因的陰性對照中未擴增出條帶，初步證實外源基因已轉(zhuǎn)入地被菊‘紫妍’中，獲得陽性單株10株(圖5)。將轉(zhuǎn)基因植株移至營養(yǎng)土中30 d后，生長狀況良好(圖6)。

抗性苗生根(A)；抗性苗(B)；假陽性苗(C)

含有目的基因的質(zhì)粒為陽性對照(1)；陰性對照(2)；空白對照(3)；T1代的11個株系(4～14)

圖6 轉(zhuǎn)基因植株移栽后表型

3 討 論

CBF轉(zhuǎn)錄因子與植物的抗逆性密切相關(guān)，在植物處于逆境條件時可對逆境脅迫相關(guān)基因的表達起調(diào)控作用，從而增強植物的抗逆性[14]?；粜阄牡萚15]從擬南芥中擴增得到CBF4的上游DNA片段，并與GUS基因融合構(gòu)建雙元表達載體，將其成功轉(zhuǎn)入煙草后進行組織特異性檢測后見明顯的GUS活性，從而證明CBF4基因為干旱誘導(dǎo)型啟動子。徐春波等[16-17]通過建立植物表達載體HpBPC26-CBF4，將克隆出的擬南芥CBF4基因利用基因槍法順利轉(zhuǎn)入蒙農(nóng)雜種冰草中。李利斌等[18]從大白菜中克隆出同源基因BrCBF4，并對它的序列特征、蛋白結(jié)構(gòu)和遺傳進化體系進行分析，證明BrCBF4與擬南芥AtCBF4屬同一個類群，且在功能上相似。劉杰從甘菊當中克隆出ClCBF4基因，在建立植物表達載體后成功轉(zhuǎn)入擬南芥。為其他物種中CBF4基因克隆及轉(zhuǎn)化的研究奠定基礎(chǔ)。

在遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立過程中，預(yù)培養(yǎng)時間、侵染時間、共培養(yǎng)時間、延遲培養(yǎng)時間的確定十分必要。若受體葉片轉(zhuǎn)化前不進行預(yù)培養(yǎng)，葉片切口處因處于受傷狀態(tài)而十分敏感，直接被菌液侵染會導(dǎo)致葉片因抵抗力差而無法正常生長甚至死亡。若預(yù)培養(yǎng)時間過長，葉片切口處有可能已經(jīng)愈合，很難被菌液感染[19-20]。外源基因整合到T-DNA中不僅僅是靠菌液侵染的一段時間，轉(zhuǎn)化中的共培養(yǎng)過程是外源基因?qū)氲牧己脮r機，在共培養(yǎng)過程中，由于黑暗條件和溫度的適宜性，侵染時附著在受體葉片上的菌絲會迅速擴增，進一步侵染葉片傷口，增加轉(zhuǎn)化幾率。共培養(yǎng)時間對葉片的影響和侵染時間相似，若共培養(yǎng)時間過短，葉片不能很好感染菌液，不能產(chǎn)生抗性芽；若共培養(yǎng)時間過長，菌液增長速度很快，會發(fā)生大面積腐蝕葉片的現(xiàn)象，增加轉(zhuǎn)后葉片死亡率。共培養(yǎng)過程中應(yīng)及時觀察，若出現(xiàn)菌落生長過快而腐蝕葉片時，應(yīng)提早結(jié)束共培養(yǎng)，進入延遲培養(yǎng)階段。延遲培養(yǎng)階段所需要用到的一種抗生素是抑菌劑。常用的脫菌抗生素是頭孢霉素和羧芐青霉素，雖然許多專家學者認為頭孢霉素的加入在抑菌的同時也會抑制葉片分化[21]，但絕大部分研究依然使用頭孢霉素。本試驗選取對葉片分化抑制較小的羧芐青霉素。試驗從多角度分析后，選取羧芐霉素200 mg·L-1作為抑制農(nóng)桿菌生長的最適質(zhì)量濃度。對地被菊而言，常用的轉(zhuǎn)后篩選劑是卡那霉素，使用質(zhì)量濃度一般為0～50 mg·L-1，崔新利等[22]和許志茹等[23]分別利用潮霉素和甘露糖進行地被菊轉(zhuǎn)后篩選，也得到很好的效果。適宜的篩選濃度是既能保證抗性芽和抗性植株不因篩選劑濃度過大而被篩死，又不能因濃度過小而增加后期繼續(xù)篩選的工作量。很多品種地被菊的篩選都選取10 mg·L-1作為篩選質(zhì)量濃度，與本試驗結(jié)果略有差異，原因可能是地被菊品種不同，基因型不同，導(dǎo)致植株對于卡那霉素的反應(yīng)程度不同，所以不同品種地被菊的適宜篩選劑濃度沒有共用性和借鑒性[24]。

有的研究表明，轉(zhuǎn)入高表達量的外源基因后植株的生長可能會發(fā)生畸形現(xiàn)象[25]。本試驗將PCR鑒定得到的陽性植株擴繁后移栽到營養(yǎng)土中，30 d后觀察發(fā)現(xiàn)植株長勢良好，葉片較大、莖節(jié)粗壯。但轉(zhuǎn)入的外源基因ClCBF4究竟調(diào)控哪些下游基因的表達以及植株轉(zhuǎn)入該基因后的抗逆性還需進一步研究。

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(責任編輯：郭柏壽 Responsible editor:GUO Baishou)

Establishment ofAgrobacteium-mediated Transformation System ofChrysanthemumgrandiflorum‘Ziyan’

ZHOU Yunwei, LIU Yu, MA Xin, GAO Wenjie and HE Miao

(College of Landscape Architecture, Northeast Forestry University,Harbin 150040, China)

Several factors, affectingAgrobacterium-mediated transformation ofChrysanthemumgrandiflorum‘Ziyan’ were studied based on the establishment of high efficient regeneration system.The results showed that the most suitable concentration of Km for leaf differentiation and plant rooting is 4 mg·L-1and 6 mg·L-1. The most suitable concentration of Carb for inhibiting the growth ofAgrobacteriumtumefaciensis 200 mg·L-1. The pre-culture time of 2 days and Co-culture for 2 days were beneficial for improving transformation frequency. The 8 min bacteria infection (OD600=0.5) with delay-culture of 3 days were found to be optimal selection for transgenic plantlets. It was confirmed by using gene PCR test that the vector was integrated into the regeneration genome ofChrysanthemumgrandiflorum‘Ziyan’ and the transgenicChrysanthemumgrandiflorumwhich were transplanted survived and grew well.

Chrysanthemumgrandiflorum; Genetic transformation;Agrobacteiumtumefaciens;ClCBF4

ZHOU Yunwei,female,professor.Research area:genetics resources of landscape plant.E-mail：dlzhyw@nefu.edu.cn

HE Miao, female,associate professor.Research area:genetics resources of landscape plant.E-mail:hemiao_xu@126.com

2016-04-20

2016-07-25

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費資助(201404202)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(2572015EY03)。

周蘊薇，女，教授，研究方向為園林植物種質(zhì)資源。E-mail：dlzhyw@nefu.edu.cn

何 淼，女，副教授，研究方向為園林植物種質(zhì)資源。E-mail：hemiao_xu@126.com

日期：2016-12-12

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161212.1117.032.html

S682.1+1

A

1004-1389(2016)12-1861-09

Received 2016-04-20 Returned 2016-07-25

Foundation item Special Fund for Forest Scientific Research in the Public Welfare(No.201404202);Fundamental Research Funds for the Central Universities(No.2572015EY03).