閆海龍，馬志杰，成 功，陳生會，王 斌，謝銀祿，屈 雷，昝林森

(1.西北農林科技大學 動物科技學院，陜西楊凌 712100；2.榆林學院 生命科學研究中心，陜西榆林 719000；>3.青海省畜牧獸醫(yī)科學院,西寧 810016；4.神木縣畜牧獸醫(yī)技術推廣站，陜西神木 719300；5.青海省格爾木市畜牧獸醫(yī)站，青海格爾木 816000)

陜北地區(qū)秦川牛及其多個雜交后代群體的遺傳多樣性

閆海龍1,2，馬志杰3，成 功1，陳生會4，王 斌4，謝銀祿5，屈 雷2，昝林森1

(1.西北農林科技大學 動物科技學院，陜西楊凌 712100；2.榆林學院 生命科學研究中心，陜西榆林 719000；>3.青海省畜牧獸醫(yī)科學院,西寧 810016；4.神木縣畜牧獸醫(yī)技術推廣站，陜西神木 719300；5.青海省格爾木市畜牧獸醫(yī)站，青海格爾木 816000)

為了解陜北地區(qū)黃牛的遺傳多樣性及遺傳背景，采用直接測序技術對55頭飼養(yǎng)在陜北榆林地區(qū)的秦川牛及其多個雜交后代群體的線粒體DNA D-loop區(qū)826 bp序列進行測定。結果表明，榆林地區(qū)黃牛D-loop 區(qū)序列A+T平均含量為61.5%，G+C含量38.5%；共檢測到33種單倍型和84個變異位點，核苷酸多樣度(π)為0.021 43,單倍型多樣度(h)為0.970，表明陜北榆林地區(qū)的黃牛具有豐富的遺傳多樣性。NJ法聚類結果顯示，該地區(qū)的黃牛品種或群體有2個母系起源。

陜北地區(qū)；秦川牛；線粒體D-loop；遺傳多樣性

黃牛作為牛屬遺傳資源寶庫中的一部分，具有耐粗飼、耐寒、抗病力強、肉味濃郁而不腥臊等優(yōu)點，在中國分布廣泛。由于國內一些地方存在盲目引進外來品種雜交的現(xiàn)象，造成本地黃牛品種的數(shù)量不斷減少，使寶貴的基因資源丟失。因此，對國內黃牛的品種資源進行調查與研究，對于黃牛品種的合理保護與利用都是一件必要的工作。

目前，許多研究都集中在黃牛的起源、演化和分類方面，并且取得大量的成果?！吨袊Ｆ贩N志》中按地理分布區(qū)域將中國的黃牛品種劃分為北方黃牛、中原黃牛和南方黃牛[1]。通過分析血液蛋白多態(tài)性發(fā)現(xiàn)中國北方牛屬于普通牛，而且北方牛群體品種內雜合度較低，而海南牛可能是另外一個瘤牛的發(fā)源地[2]。通過Y染色體多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，北方黃牛受普通牛影響大，南方黃牛受瘤牛影響大，而中原黃牛受普通牛和瘤牛的影響均等[3]。線粒體D-環(huán)高變區(qū)序列( mtDNA D-loop hypervariable segment)在不同種間、種內不同群體間具有廣泛多態(tài)性，可以作為一種可靠的遺傳標記。根據(jù)mtDNA D-loop序列變異，被廣泛用于研究品種或群體的起源、演化和分類。賴松家等[4-5]研究報道，中國北部和西部只有4.3%的牛屬于瘤牛型，中原地區(qū)有39.3%的牛屬于瘤牛型，南部和西南部牛有44%屬于瘤牛型。雷初朝等[6-7]對8個中國黃牛品種mtDNA序列中D-loop區(qū)全序列進行多態(tài)性研究，發(fā)現(xiàn)中國北方黃牛有三大母系起源，分別為普通牛、瘤牛和不明身份的母系。

陜西北部榆林地區(qū)的黃牛處于蒙古牛飼養(yǎng)區(qū)和秦川牛飼養(yǎng)區(qū)的交界區(qū)，因其較強的適應性和產(chǎn)肉性能已成為當?shù)刂饕男蠓N資源之一。但迄今為止，很少有學者對這一地區(qū)黃牛的遺傳資源狀況進行研究，許多地方品種資源受到外來品種侵襲，導致當?shù)攸S牛生產(chǎn)性能下降，因此，調查陜北榆林地區(qū)黃牛的母系遺傳背景和遺傳結構，為選育工作提供理論依據(jù)。本研究采用mtDNAD-loop 序列作為分子標記，對榆林地區(qū)的黃牛母系遺傳背景進行研究，旨在為研究中國黃牛的起源演化和遺傳多樣性提供基礎資料，對指導中國地方黃牛定向選育及牛種遺傳資源保護具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以陜北榆林地區(qū)秦川牛及其雜交后代為研究對象，分別為：秦川牛(QCH)33 頭，秦川牛(母本)與安格斯雜交后代(QCHAGS)12 頭，秦川牛(父本)與蒙古牛雜交后代(QCHZM)7 頭，秦川牛(父本)與本地黃牛雜交后代(QCHBD)3 頭，共計采集55 頭黃牛血樣，各10 mL左右。血液加抗凝劑帶回實驗室后-80 ℃保存，備用。

1.2 試驗方法

按照常規(guī)的酚-氯仿法提取牛的總DNA[8]，用紫外分光光度計和凝膠電泳雙重檢測其質量濃度和純度，調整終質量濃度到50～100 ng/μL，備用。線粒體DNA D-loop 擴增引物為黃牛的特異性引物，引物設計參照Loftus等[9]和Wu等[10]研究。上游引物為： 5′-CTGCAGTCTCACCATCAACC-3′; 下游引物為: 5′-GGGGTGTAGATGCTTGC-3′。引物由上海生工技術服務有限公司合成。

PCR 擴增體系總體積為50 μL，反應條件：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min，30 個循環(huán)；最后68 ℃充分延伸10 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物用10 g/L 的瓊脂糖凝膠電泳檢測其大小、純度及質量濃度。每個樣品取5 μL用于檢測，對于擴增效果良好且足量的樣品，用Omega 公司(美國) 回收試劑盒對其剩余的45 μL PCR 產(chǎn)物進行純化與回收?；厥蘸蟮腜CR 產(chǎn)物由上海生工技術服務有限公司測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Chromas 2.33 ( http://www.Technelysium.com. Au/chromas.html)軟件對原始序列進行編輯；用BioEdit 7.0.9軟件中的Clustal Wmultiple alignment程序將測定的秦川牛及其雜交后代相應序列進行多序列比對；采用DnaSP 4.10.3 (http://www.ub:Es/dnasp ) 軟件進行序列多態(tài)位點、單倍型多樣性和核苷酸多樣性分析，確定核苷酸變異類型、單倍型數(shù)目和類型，計算單倍型多樣度(h)和核苷酸多樣度(π)[11]；用MEGA Ver4.0 軟件統(tǒng)計序列的長度和堿基組成，以鄰接法(Neighbor-Joining，NJ) 構建品種或群體間聚類關系。

2 結果與分析

2.1 序列變異

通過對陜北榆林地區(qū)秦川牛及其雜交后代4個群體55個個體D-loop 區(qū)826 bp序列進行統(tǒng)計分析，結果表明，A+T堿基含量平均為61.5%，G+C含量平均為38.5%，說明榆林地區(qū)黃牛D-loop區(qū)富含A+T堿基，核苷酸組成存在一定的偏倚性。

以本研究中的單倍型1作為標準(圖1)，共發(fā)現(xiàn)轉換和顛換位點84 處，占分析序列總長度的10.17%，其中27 處位點均為兩核苷酸變異的單一多態(tài)位點，約占3.27%；52處位點均為兩核苷酸變異的簡約信息位點，約占6.29%；5處位點均為三核苷酸間變異的簡約信息位點；未發(fā)現(xiàn)四核苷酸間的變異。序列間檢測到3種突變類型: 即轉換、顛換及轉換/顛換共存。其中轉換71次(占75.53%)：A與G的轉換28次，占29.79%；C與T的轉換43次，占45.74%；顛換23次(占24.47%)： A與C的轉換7次，占7.45%；G與T的轉換2次，占2.13%；A與T的顛換9次，占9.57%；G與C的顛換5次，占5.22%。

2.2 單倍型多樣度及系統(tǒng)發(fā)育分析

對陜北榆林地區(qū)黃牛的mtDNA D-loop區(qū)多序列比對分析后發(fā)現(xiàn)圖1，確定33種單倍型。其中單倍型Hap1和Hap32各有6個個體共享，為優(yōu)勢單倍型。分別有3個個體共享單倍型Hap7和Hap33，而單倍型Hap2、Hap4、Hap6、Hap9、Hap18、Hap19、Hap23和Hap28各有2個個體共享，其余個體均擁有各自獨立的單倍型(即Hap3、Hap5、Hap8、Hap10-17、Hap20-22、Hap24-27 和Hap29-31)。序列平均核苷酸差異K為17.097 64，π為0.021 43，h為0.970。

以水牛(Genbank No.: JN632607)相應序列作為外群，以陜北榆林地區(qū)黃牛mtDNA D-loop序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖2可以看出，陜北榆林地區(qū)黃牛明顯分為2個分支，即Clade A和Clade B，說明陜北榆林地區(qū)黃?？赡苡?個母系來源。

圖1 陜北榆林地區(qū)黃牛mtDNAD-loop區(qū)的33 種單倍型

3 討 論

近年來，動物mtDNA研究的熱點之一是mtDNA D-loop區(qū)序列的核苷酸變異分析，國外有關牛mtDNA D-loop區(qū)序列的核苷酸變異報道較多[12-15]。在國內研究中，雷初朝等[16]研究發(fā)現(xiàn)22 頭中國黃牛個體mtDNA D-loop區(qū)存在19種單倍型，A+T平均含量為61.65%，G+C平均含量為38.35%。本研究對陜北榆林地區(qū)秦川牛及其雜交后代的mtDNA D-loop區(qū)826 bp序列分析發(fā)現(xiàn)：共有33 種單倍型，A+T的平均含量為61.5%，G+C的平均含量為38.5%；榆林地區(qū)黃牛mtDNA D-loop區(qū)序列的結構特征和核苷酸組成與前人研究[16]結果基本一致，說明本次測序的結果是正確可靠的，另一方面也說明榆林本地的黃牛mtDNA D-loop區(qū)與中國其他地區(qū)的黃牛具有相似的結構特征和組成。然而，本研究并未對mtDNA D-loop區(qū)全序列進行測序，因此關于序列長度是否發(fā)生變異有待進一步分析。

通常在線粒體基因組DNA進化過程中主要以堿基替換為主，插入和缺失現(xiàn)象較少[17]，堿基替換又分為轉換和顛換2種形式，而且發(fā)生轉換的頻率要遠遠高于顛換。本研究，共發(fā)現(xiàn)3 種變異類型: 即轉換、顛換及轉換/顛換共存。檢測到的84 處核苷酸變異位點中，其中轉換71 個、顛換23 個，說明轉換率明顯高于顛換率，該研究結果與哺乳動物的mtDNA D-loop區(qū)進化特點相同[6]。Loftus等[9]對歐洲牛、印度瘤牛及非洲牛共計13 個品種的D-loop 區(qū)全序列分析發(fā)現(xiàn)：共存在24種單倍型，63個核苷酸變異位點，其中轉換59個，顛換1個，2個插入/缺失，1個Poly(C)區(qū)長度變異。雷初朝等[16]的研究表明，中國8個黃牛品種22個個體D-loop區(qū)全序列中，存在66個核苷酸位點發(fā)生突變，其中轉換54個，顛換4個，插入5個，缺失2個，轉換與顛換共存位點1個。本研究發(fā)現(xiàn)，陜北榆林地區(qū)黃牛D-loop 區(qū)序列的核苷酸替換數(shù)目稍微高于歐洲牛、印度瘤牛、非洲牛，以及中國其他地區(qū)黃牛，但是本研究中并未發(fā)現(xiàn)插入和缺失，這可能與樣本數(shù)量、測序長度或品種差異有關。另外，本研究在陜北榆林地區(qū)秦川牛及其雜交后代中發(fā)現(xiàn)5 處三核苷酸間變異的簡約信息位點，有待進一步研究。

圖2 陜北榆林地區(qū)黃牛mtDNAD-loop序列NJ分子系統(tǒng)樹

衡量群體DNA遺傳多樣性的指標，主要是單倍型多樣度(h)和核苷酸多樣度(π)，單倍型多樣度(h)是指樣本中隨機抽取的序列互不相同的頻率，單倍型多樣度(h)高的群體說明其遺傳多樣性高，而堿基的多樣性和結構的多樣性決定核苷酸多樣度(π)。劉若余等[18]研究表明貴州關嶺黃牛D-loop區(qū)全序列的單倍型多樣度(h)為0. 909，核苷酸多樣度(π)為2. 29%。周艷等[19-20]發(fā)現(xiàn)云南昭通黃牛的單倍型多樣度(h)為0. 952± 0. 096，核苷酸多樣度(π)為2. 504%；而南方黃牛品種單倍型多樣度(h)為0.750±0.074，核苷酸多樣度(π)為2.25%。在本研究中，mtDNA D-loop區(qū)部分序列的單倍型多樣度(h)為0.970，核苷酸多樣度(π)為2.143%，與前人對其他黃牛品種的遺傳多樣性評估基本相似，表明陜北榆林地區(qū)的黃牛具有豐富的遺傳多樣性。但是魏磊等[21]根據(jù)mtDNA的MHC基因數(shù)據(jù)報道，發(fā)現(xiàn)皖北黃牛品種單倍型多樣度(h) 為0.602～0.617，π為0.012～0.019，遺傳多樣性比較貧乏；雷初朝等[16]發(fā)現(xiàn)中國8個黃牛品種的π值為0.55%～5.39%；此外，Loftus研究表明歐洲牛品種、非洲牛品種和印度瘤牛品種的π為0.11%～0.92%[9]。上述研究表明，各牛品種π具有一定程度的差異，其主要原因認為是普通牛和瘤牛祖先分化較早，而中國黃牛的一些品種同時具有瘤牛血統(tǒng)和普通牛血統(tǒng)混合起源，序列間的變異較大，故所測π值較高。

長期以來，黃牛作為世界上最有經(jīng)濟價值的家畜之一，其起源進化和遺傳多樣性一直是研究的熱點和育種工作的關鍵。通過系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，陜北榆林地區(qū)的黃牛群體明顯分為2支，說明其可能有兩個母系起源，但是究竟這2個母系起源于何處，還有待進一步研究。

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(責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Genetic Diversity of Qinchuan Cattle and Its Hybrids in the Northern Shaanxi Province

YAN Hailong1,2,MA Zhijie3,CHENG Gong1,CHEN Shenghui4, WANG Bin4,XIE Yinlu5,QU Lei2and ZAN Linsen1

(1.College of Animal Science and Technology,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China; 2.Life Science Research Center,Yulin University,Yulin Shaanxi 719000,China; 3.Qinghai Academy of Animal Science and Veterinary Medicine,Xining 810016,China; 4.Extension Station of Animal Husbandry and Veterinary Medicine of Shenmu County,Shenmu Shaanxi 719300, China；5.Station of Animal Husbandry and Veterinary of Golmud City in Qinghai Province,Golmud Qinghai 816000,China)

To explore the genetic diversity and genetic background of Qinchuan cattle and its hybrids in Northern Shaanxi Province,826 bp mtDNA D-loop sequences from 55 Qinchuan cattle and its hybrids were sequenced and analyzed. The results showed that the content of A+T bases was 61.5%,while the percentage of G+C bases was 38.5%. We also found 84 mutation sites which identified 33 haplotypes.The nucleotide diversity was 0.021 43 and the haplotype diversity was 0.970,which indicated that abundant mitochondrial genetic diversity exists in cattle from Yulin region in Northern Shaanxi province.Phylogenetic analysis by using the NJ method showed that all the sequences were clustered into two major clades. The results indicated that there were two maternal origins to Qinchuan cattle and its hybrids in Yulin region.

The Northern Shaanxi； Qinchuan cattle；mtDNA D-loop；Genetic diversity

YAN Hailong,male,lecturer,doctoral student. Research area: livestock breeding and reproduction. E-mail: ylhailong@126.com

ZAN Linsen,male,professor,Ph.D,doctoral supervisor. Research area: genetics,breeding and reproduction of beef cattle and dairy cattle. E-mail: zanlinsen@163.com

2016-03-22

2016-04-29

國家“863”計劃(2013AA102505)；國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術體系(CARS-38)；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃(2014KTZB02-02)。

閆海龍，男，講師，博士研究生，主要從事家畜育種與繁殖研究。E-mail：ylhailong@126.com

昝林森，男，教授，博士，博士生導師，主要從事肉牛奶牛遺傳育種與繁殖研究。E-mail：zanlinsen@163.com

日期：2016-12-12

網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161212.1114.002.html

S813.1

A

1004-1389(2016)12-1749-06

Received 2016-03-22 Returned 2016-04-29

Foundation item The National High-Technology Research and Development Program(“863” Program) (No.2013AA102505); National Beef Cattle Industrial Technology System (No.CARS-38)；Innovation Project of Science and Technology of Shaanxi (No. 2014KTZB02-02).