張紫恒，楊 娜，胡 聰，杜 洋，袁黎明

(云南師范大學 化學化工學院，云南 昆明 650500)

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α-酸糖蛋白手性柱對56種手性化合物的拆分

張紫恒，楊 娜，胡 聰，杜 洋，袁黎明*

(云南師范大學 化學化工學院，云南 昆明 650500)

采用α-酸糖蛋白手性固定相(Chiral-AGP)，固定流動相pH、流速，化合物樣品濃度，考察酸性、堿性、中性手性化合物和21個氨基酸在α-酸糖蛋白手性柱上的拆分情況.應(yīng)用高效液相色譜法，α-酸糖蛋白手性柱對上述手性樣品拆分，一共有8個中性化合物、3個堿性化合物、6個酸性化合物和5個氨基酸得到手性對映分離.探討了α-酸糖蛋白手性柱對酸性、中性、堿性樣品的拆分能力并進行對比，結(jié)果證明α-酸糖蛋白手性柱拆分中性化合物和酸性化合物效果最好，拆分堿性化合物和氨基酸效果不好，為α-酸糖蛋白手性柱適合于拆分哪一類型的手性化合物提供參考.

α-酸糖蛋白；手性拆分；液相色譜；手性化合物

手性(chirality)一詞，來源于希臘語中的“cheir”,是指物體與它的鏡像互不重疊的現(xiàn)象，是人類賴以存在的自然界的本質(zhì)屬性之一[1].目前最廣泛采用的手性分析技術(shù)是高效液相色譜(HPLC),其可分為手性固定相法、手性試劑衍生化法和手性流動相添加劑法.手性固定相法因其簡單、快速和準確的優(yōu)點,已成為分析和分離對映體的最重要的方法[2-4].由于手性化合物存在著對映異構(gòu)分子之間具有不同的光學性能和生物活性，其拆分在藥學和生物學等領(lǐng)域具有十分重要的意義[5].酸糖蛋白手性柱(Chiral-AGP)因其α-酸糖蛋白(AGP)是一種非常穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，它不但能耐高濃度的有機溶劑，也耐高溫以及較高或較低的pH，用途十分廣泛，是所有手性柱中應(yīng)用范圍最廣的，可以分離所有類型化合物，胺(伯、仲、叔、季胺)、酸(強和弱)、非光解質(zhì)(酰胺，酯，醇，亞砜等)[6-7].本研究通過考察不同種類的手性化合物應(yīng)用高效液相色譜在Chiral-AGP上的拆分效果，確定其在哪種類型的手性化合物上有更優(yōu)越的拆分效果，為使用Chiral-AGP的實驗員提供更好的選擇.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

大連依利特液相色譜儀(伊利特分析儀器有限公司，大連)配有P230Ⅱ型高壓恒流泵和UV230Ⅱ型紫外-可見檢測器，儀器控制和數(shù)據(jù)采集EC-2006液相色譜工作站，手性色譜柱酸糖蛋白手性柱(Chiral-AGP)購于大賽璐有限公司；手性化合物和氨基酸購于Fluka和Sigma公司，乙酸銨、乙酸均為分析純購于天津市風船化學試劑科技有限公司，甲醇、異丙醇為進口色譜純試劑，其余試劑為國產(chǎn)分析純.

1.2 色譜條件

色譜柱:Chiral-AGP柱(150 mm×4.6 mm,性質(zhì)穩(wěn)定的α-酸糖蛋白牢固地鍵合到粒徑為5μm的球形硅膠上的手性固定相)；流動相： 0.01 mol/L乙酸銨(pH=5.8)∶2-丙醇=95∶5(體積比，下同)，柱溫：室溫，流動相流速：0.9 mL/min，壓力上線：140 kg/cm2，檢測波長200、254 nm.流動相使用前用0.45 μm濾膜過濾，并經(jīng)超聲波脫氣.以1,3,5三叔丁基苯為溶質(zhì)，測定死時間.

1.3 樣品和流動相的制備

樣品制備：35種液相手性樣品溶于純色譜純甲醇，21種氨基酸溶于高純水，濃度均為1 g/L.

流動相制備：首先配制0.01 mol/L乙酸銨，用乙酸調(diào)節(jié)其pH為5.8，再按照流動相所需比例制備，使用前用0.45 μm濾膜過濾，然后超聲脫泡.

2 結(jié)果與討論

2.1 酸糖蛋白手性柱對中性手性化合物的拆分性能

手性柱：Chiral-AGP柱，0.01 mol/L乙酸銨緩沖液(pH=5.8)-異丙醇(95∶5)為流動相，流速為0.9 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫為25 ℃，進樣量5 μL，此條件下拆分15個中性手性化合物，其中有8個手性化合物得到了很好的拆分效果，分別是3號、5號、6號、7號、8號、10號、13號、14號.具體拆分結(jié)果見圖1及表1.

圖1 8個中性化合物在Chiral-AGP柱上的拆分譜圖

Table 1 Results of resolution for 15 neutral chiral compounds on Chiral-AGP column

序號中性手性化合物保留因子(κ'1)分離因子(α)分離度(Rs)1號氧氟沙星9.57--2號1-(9-蒽基)-2,2,2-三氟乙醇---3號1-(1-萘基)-乙醇4.651.562.194號1,1'-聯(lián)-2-萘酚---5號1,2-二苯基乙二醇0.801.491.616號聯(lián)糠醛0.321.551.077號1,2-二苯乙醇酮2.651.191.258號二氫黃酮12.231.451.089號反-1,2-二苯環(huán)氧乙烷9.85--10號特羅格爾堿4.481.440.6711號3,5-二硝基-N-(1-苯乙基)甲苯酰胺4.07--12號華法林---13號吡喹酮3.201.230.7514號奧美拉唑0.80--15號1-對氯苯基-乙醇0.74--

2.2 酸糖蛋白手性柱對堿性手性化合物的拆分性能

色譜條件：同3.1.拆分12個堿性手性化合物，有3個手性化合物得到較好的拆分效果，分別是17號、21號和22號.具體拆分結(jié)果見圖2及表2.

圖2 3個堿性化合物在Chiral-AGP柱上的拆分譜圖

表2Chiral-AGP柱對12個堿性手性化合物的拆分結(jié)果

Table2Chiral-AGPcolumnof11basicchiralcompoundssplitresults

序號堿性手性化合物保留因子(κ'1)分離因子(α)分離度(Rs)16號馬來酸氯苯那敏4.01--17號鹽酸普萘洛爾11.211.130.8418號阿替洛爾0.71--19號美托洛爾0.87--20號沙丁胺醇---21號氨氯地平18.231.200.5422號鹽酸克倫特羅3.141.392.1923號硫酸特布他林1.87--24號腎上腺素1.34--25號2-氨基-1-丁醇---26號四咪唑1.78--27號佐匹克隆---

2.3 酸糖蛋白手性柱對酸性手性化合物的拆分性能

色譜條件：同3.1.此條件下拆分8個酸性手性化合物，其中有6個手性化合物得到了很好的拆分效果，分別是28號、30號、31號、32號、33號和35號.具體拆分結(jié)果見圖3及表3.

圖3 6個酸性化合物在Chiral-AGP柱上的拆分譜圖

Table 3 Resolution results of eight acidic chiral compounds on Chiral-AGP column

序號酸性手性化合物保留因子(κ'1)分離因子(α)分離度(Rs)28號DL-扁桃酸0.024.350.3929號DNB-亮氨酸0.30--30號布洛芬1.291.230.4231號酮洛芬2.931.371.0232號萘普生3.631.250.9533號氟比洛芬6.701.341.3834號西替利嗪12.34--35號馬來酸噻嗎咯爾0.0528.085.69

2.4 酸糖蛋白手性柱對氨基酸手性化合物的拆分性能

色譜條件：檢測波長為200nm，其他條件同3.1.此條件下拆分21個氨基酸，其中有5個得到了一定的拆分效果，分別是谷氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、丙氨酸和纈氨酸，具體拆分結(jié)果見圖4及表4.

圖4 5個氨基酸化合物在Chiral-AGP柱上的拆分譜圖

Table4Resolutionresultsof21aminoacidonChiral-AGPcolumn

氨基酸手性化合物保留因子(κ'1)分離因子(α)分離度(Rs)DL-丙氨酸0.0848.887.23DL-纈氨酸0.17--DL-亮氨酸0.03--DL-異亮氨酸0.02--DL-脯氨酸0.05--DL-苯丙氨酸0.04--DL-色氨酸0.50--DL-酪氨酸0.10--DL-對羥基苯甘氨酸0.24--DL-苯甘氨酸0.26--DL-絲氨酸0.059.41.21DL-蘇氨酸0.116.551.01DL-半胱氨酸0.26--DL-甲硫氨酸0.18--DL-天冬酰胺0.14--DL-谷酰胺0.082.750.61DL-天冬氨酸0.062.410.56DL-谷氨酸0.09--DL-賴氨酸---DL-精氨酸0.86--DL-組氨酸0.92--

2.5 討論

Chiral-AGP手性柱在高效液相色譜分離分析中具有廣泛應(yīng)用且適用于所有手性化合物的對映體分離，包括：胺類化合物、酸性化合物和非質(zhì)子化合物.本實驗中主要考察了Chiral-AGP手性柱對中性化合物、堿性化合物，酸性化合物以及氨基酸手性樣品的手性分離情況.結(jié)果表明，在高效液相色譜檢測中，Chiral-AGP手性色譜柱對酸性、堿性、中性手性化合物以及氨基酸中都有拆分效果，其中Chiral-AGP手性柱對15中性化合物拆分，有8個手性化合物得到較好的拆分效果；對8個酸性化合物拆分，有6個手性化合物得到較好拆分效果；對12個堿性化合物拆分，有3個手性化合物得到較好拆分效果；對21個氨基酸拆分，有5個氨基酸得到一定的拆分效果.由于Chiral-AGP手性固定相是α-酸糖蛋白，在酸性條件下比較穩(wěn)定，在流動相為酸性(pH=5.8)并添加一定量的緩沖溶液的情況下，根據(jù)“三點作用”經(jīng)典手性識別理論，酸性化合物與中性化合物對映體更容易與α-酸糖蛋白發(fā)生可逆相互作用，根據(jù)形成締合物的難易程度和穩(wěn)定程度使得另一對映體優(yōu)先洗脫，經(jīng)過多次平衡之后，達到對映體的分離.同時在酸性流動相環(huán)境下，堿性化合物和氨基酸與流動相的H+、緩沖液產(chǎn)生某些弱相互作用力，與固定相比較難產(chǎn)生一定的吸附作用力，因此堿性化合物和氨基酸并不能夠容易地在Chiral-AGP手性柱上得到理想的拆分效果.因此，Chiral-AGP手性柱在拆分中性和酸性化合物呈現(xiàn)出優(yōu)異的對映體分離效果；在分離堿性手性化合物和氨基酸時效果不太好.因此，中性及酸性化合物可以選擇用Chiral-AGP手性柱拆分，堿性化合物和氨基酸可以選擇其他對此類化合物有更好的拆分性能的商品柱進行拆分.

3 結(jié)論

選擇色譜條件：流動相乙酸銨緩沖液(pH=5.8)-異丙醇，流速0.9 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫為25 ℃，進樣量5 μL，用Chiral-AGP手性柱拆分56種手性化合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有22種手性化合物得到較好的手性拆分，充分證明了商品Chiral-AGP手性柱是一種優(yōu)秀的手性柱.從試驗結(jié)果可以得出該商品柱在弱酸性環(huán)境下能夠更好地拆分酸性及中性手性化合物.

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[責任編輯：吳文鵬]

Enantiomeric separation of 56 racemates by HPLC usingα-acid glycoprotein chiral stationary phase

ZHANG Ziheng, YANG Na, HU Cong, DU Yang, YUAN Liming*

(CollegeofChemistryandChemicalEngineering,YunnanNormalUniversity,Kunming650500,Yunnan,China)

Fixed pH, velocity and compounds’ concentration of mobile phase, enantiomeric separation of acid, alkali, neutral chiral compounds and 21 amino acids was explored by HPLC using Chiral-AGP.A total of eight neutral compounds, three basic compounds, six acidic compounds and five amino acids had been enantiomeric separated applying HPLC, usingα-Acid Glycoprotein chiral stationary phase.The capability of Chiral-AGP to chiral resolution of acid, alkali, neutral chiral compounds was investigated.The results proved that the acid and neutral compounds can be used in the best resolution, however, the effect of resolution is poor for alkali and amino acids.This paper offers a reference for the apphication of chiral AGP to separate chiral compounds.

α-acid glycoprotein; chiral separation; liquid chromatography; chiral compounds

2016-07-26.

國家自然科學基金(21275126).

張紫恒(1990-), 男, 碩士生，研究方向為高分子化學與物理.*

O658

A

1008-1011(2016)06-0737-05