趙湧頻 余思遜 劉偉民

(1.貴陽市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州 貴陽 550002;2.成都軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科，四川 成都 610000 )

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TRPC6在結(jié)節(jié)性硬化癥癲癇患者皮層腦組織中的表達

趙湧頻1余思遜2劉偉民1

(1.貴陽市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州 貴陽 550002;2.成都軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科，四川 成都 610000 )

目的 研究瞬時受體電位通道蛋白C6(TRPC6)在結(jié)節(jié)性硬化癥(TSC)癲癇患者皮層腦組織的表達與分布，探討TRPC6通道參與結(jié)節(jié)性硬化致癇的可能機制。方法收集手術(shù)切除并經(jīng)病理檢測證實是TSC癲癇患者的皮層腦組織標本18例，與7例正常對照皮層腦組織比較，通過采用Western blot、免疫組化、免疫熒光雙標，檢測TRPC6在正常腦組織與TSC病理標本中的表達分布情況。結(jié)果Western blot蛋白檢測結(jié)果顯示，在TSC和對照大腦皮質(zhì)(CTX)TRPC6均在相應(yīng)的分子量94KDa處有特異性蛋白條帶，與CTX比較，TSC組TRPC6條帶與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值之比顯著增高(P<0.05)；免疫組化及免疫熒光雙標結(jié)果顯示，TRPC6在TSC病灶中免疫強度明顯增高，且特異性高表達于皮層損傷區(qū)致癇灶中的異構(gòu)神經(jīng)元，包括特征性的巨形細胞(GCs)、異形神經(jīng)元(DNs)。結(jié)論TRPC6在結(jié)節(jié)性硬化癥患者致癇皮層腦組織中表達異常增高，特異性的細胞分布模式可能與癲癇發(fā)病密切相關(guān)。

瞬時受體電位通道蛋白C6； 結(jié)節(jié)性硬化癥； 癲癇

結(jié)節(jié)性硬化癥 (TSC)是由TSC1(蛋白產(chǎn)物為hamartin)或TSC2(蛋白產(chǎn)物為tuberin)基因突變所引起的常染色體顯性遺傳的多系統(tǒng)疾病，其臨床主要表現(xiàn)為癲癇、智力低下和皮脂腺腺瘤(Vogt三聯(lián)征)[1-2]。目前，TSC已成為兒童藥物難治性癲癇的重要病因之一。TSC癲癇患者皮質(zhì)病灶區(qū)的皮質(zhì)結(jié)節(jié)是其腦損害最典型的病理性標志，臨床電生理研究發(fā)現(xiàn)，在皮質(zhì)結(jié)節(jié)出現(xiàn)的異形神經(jīng)元(DNs)和巨形細胞(GCs)可能作為TSC病灶癲癇發(fā)作的起搏點[3-4],并有研究發(fā)現(xiàn)在TSC致癇病灶區(qū)的細胞中存在鈣離子內(nèi)流而引起的神經(jīng)元電活動異常。傳統(tǒng)型TRP通道(TRPC) 作為一類可調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣濃度非特異性陽離子通道,目前其功能研究倍受關(guān)注[5-6]。TRPC6作為TRPC家族中的一個亞型，主要在哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達[7]，參與細胞膜受體激活磷脂酶C后所介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流。近年來有研究報道，TRPC6在難治性癲癇患者顳葉組織中表達上調(diào)，并推測TRPC6參與了顳葉難治性癲癇的發(fā)生，但TRPC通道在TSC癲癇患者的致癇皮層中的表達情況還未見報道。在本研究中，我們利用Western blot、免疫組化及免疫熒光雙標檢測TRPC6在結(jié)節(jié)性硬化患者病灶皮層腦組織中的表達分布情況,探討其在癲癇發(fā)作中的可能作用。

1 資料與方法

1.1 標本來源及臨床資料

收集2008年6月至2010年12月于第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除并經(jīng)病理檢測證實是TSC的腦組織皮層損傷區(qū)標本18例，其中男7例，女11例，年齡0.5～13歲，平均3.5歲。對照組正常腦組織皮層標本7例來源于2008年1月至2010年12月第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院神經(jīng)外科進行尸檢的患者，尸檢平均年齡3.8歲。本實驗經(jīng)醫(yī)院倫理委員會許可，獲得使用人體組織的書面同意書，醫(yī)療記錄僅用于研究目的。所有組織的獲取與使用符合赫爾辛基申明的要求。將收集的病理標本中出血、電灼的組織除去，等滲鹽水沖洗干凈后一部分用甲醛溶液固定，石蠟包埋，所有載玻片經(jīng)多聚賴氨酸包被處理以防脫片，連續(xù)切取約5.0 μm的切片備用。另一部分組織液氮速凍后存入-80 ℃冰箱，用于分子生物學實驗。

1.2 試劑

兔抗人TRPC6多克隆抗體購自美國Abgent公司；小鼠抗人NeuN購自美國Millipol公司；DAPI、小鼠抗人波形蛋白(Vimentin)和小鼠抗人神經(jīng)絲蛋白(NF200)購自武漢博士德公司；兔抗人GAPDH單克隆抗體購自美國Cell signal公司；Cy3標記小鼠抗人神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(GFAP)購自美國Sigma公司；CY5標記羊抗小鼠IgG購自上海碧云天公司；異硫氰酸熒光素(FITC)標記山羊抗兔IgG購自北京中杉公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG購自中杉公司；Hoechst-33258購自美國Sigma公司；羊抗兔SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒及Western blot試劑盒購自武漢博士德公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 Western blot檢測腦組織中TRPC6的表達 取對照組及病灶組腦組織各100 mg放入研磨器中，研磨至無肉眼可見碎片(冰上操作)。加入1 000 μL裂解液+10 μL蛋白酶抑制劑，繼續(xù)研磨保證充分接觸，吸取組織懸液至EP管中，冰上靜置30 min，離心12 000×g，20 min， 4 ℃； 取上清測定蛋白濃度。將備好的樣品按60 μg/道上樣于10%聚丙烯酰胺凝膠(體積分數(shù))電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜；5%脫脂牛奶(質(zhì)量體積分數(shù))室溫封閉1 h，Tris-鹽酸+吐溫緩沖液(TBST)稀釋的兔抗人TRPC6多克隆抗體(1∶600)和兔抗人GAPDH抗體(1∶1 000)，4 ℃過夜；用TBST緩沖液稀釋的辣根酶標記的山羊抗兔IgG(1∶3 000)孵育，室溫1 h；TBST漂洗后，利用凝膠成像系統(tǒng)進行化學發(fā)光并記錄(英國，SYNGENE公司，G:BOX凝膠成像系統(tǒng))。掃描后采用Quantity One軟件測定各條帶(待測蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH)的灰度值，比較二者的比值。

1.3.2 鏈霉親和素—生物素—過氧化物酶復(fù)合物(SABC)法免疫組織化學實驗檢測腦組織中TRPC6的分布 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%雙氧水(體積分數(shù))+10%甲醛(體積分數(shù))消除內(nèi)源性過氧化物酶，微波抗原修復(fù)，中火，20 min。自然冷卻后正常山羊血清+0.3% Triton X-100(體積分數(shù))室溫封閉1 h，加入抗體(TRPC6，1∶300)4 ℃過夜。室溫復(fù)溫1 h，0.01 mol/L PBS 漂洗3次，每次10 min。SABC試劑盒中山羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h，漂洗3次，加入SABC試劑，37 ℃孵育45 min。顯色試劑為高敏感二氨基聯(lián)苯胺(DAB)。蘇木精復(fù)染細胞核，脫水透明封片，顯微鏡下觀察。以上各步驟結(jié)束，均使用0.01 mol/L PBS沖洗。陰性對照取相同量的一抗稀釋液代替TRPC3抗體，其余步驟同前。

1.3.3 免疫熒光雙標記檢測TRPC6的細胞定位 切片之前處理相同，兔抗TRPC6抗體(1∶300)分別與小鼠抗GFAP(1∶500)、小鼠抗NeuN(1∶100)、小鼠抗Vimentin(1∶50)、小鼠抗NF-200(1∶100)混合后加入切片，4 ℃冰箱孵育過夜。室溫復(fù)溫1 h，0.01 mol/L PBS 漂洗3次。CY5標記山羊抗小鼠IgG(1∶500)與FITC標記山羊抗兔IgG(1∶500)混合后加入，37 ℃孵育1 h。使用Hoechst-33258復(fù)染細胞核，避光晾干后使用抗熒光淬滅封片劑封片。使用激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS-TIV，德國)掃描并拍照。

1.4 免疫染色結(jié)果評價

每個標本選取非連續(xù)的5張切片，×200鏡下每張切片取5個不重疊的視野。異構(gòu)神經(jīng)元在鏡下容易識別，只有核染色的異構(gòu)神經(jīng)元列入統(tǒng)計。免疫染色強度的分級標準：(—)，陰性；(+)，弱陽性；(++)，中度陽性；(+++)，強陽性。通過對所有目的視野染色情況平均后得出免疫強度評分，代表該切片整體染色的情況即蛋白表達情況。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 臨床TSC標本病理結(jié)果分析

TSC結(jié)節(jié)典型的病理特征為皮質(zhì)板層結(jié)構(gòu)紊亂消失，出現(xiàn)異構(gòu)神經(jīng)元，包括：(1)DNs，神經(jīng)元形狀為多角形，極性異常紊亂，胞體尼氏染色致密聚集、神經(jīng)絲豐富；(2)GCs，細胞體形巨大，卵圓形或橢圓形，HE 染色上成胞質(zhì)呈均質(zhì)的毛玻璃樣，胞核形狀怪異、偏心性分布，可有雙核。見圖1。

A：正常對照皮質(zhì)(CTX)；B：TSC皮質(zhì)結(jié)節(jié)；C：TSC皮質(zhì)結(jié)節(jié)中的DNs；D：TSC皮質(zhì)結(jié)節(jié)中的GCs。A標尺：50 μm；C-D標尺：25 μm。圖1 正常對照皮層、TSC皮質(zhì)結(jié)節(jié)的HE染色

2.2 Western blot檢測TRPC6的表達水平

Western blot檢測結(jié)果顯示，在TSC病理組織和正常腦組織中，在94KDa處均有特異性蛋白條帶。TRPC6條帶與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值之比提示，TSC病理組織中TRPC6表達較正常組織增高(P<0.05)。見圖2。

圖2 Western blot檢測TRPC6在TSC病理組織和正常腦組織中的表達

2.3 TRPC6在TSC結(jié)節(jié)中的細胞定位分布情況

2．3．1 免疫組化染色結(jié)果提示在TSC組及CTX皮層組織中，TRPC6的免疫反應(yīng)物為棕褐色；在TSC結(jié)節(jié)中，TRPC6中或強度表達于DNs和GCs，且在異構(gòu)神經(jīng)元胞體的胞膜及胞質(zhì)，神經(jīng)元突起中均有表達，同時可見TRPC6少量表達于星形膠質(zhì)細胞。18例結(jié)節(jié)性硬化癥的平均染色強度為(2.33±0.16)，7例正常對照大腦皮質(zhì)平均染色強度為(1.12±0.13)，P<0.05。見表1，圖3。

表1 TRPC6在TSC皮層結(jié)節(jié)中的表達/%

A:TRPC6在正常皮層腦組織中的表達，箭頭所示為正常神經(jīng)元(標尺25 μm)；B：TRPC6在TSC病理皮層腦組織中的表達，箭頭所示為GCs，三角所示為DNs(標尺25 μm)； C：TRPC6在GCs上強表達(標尺20 μm)；D：TRPC6在DNs上強表達(標尺10 μm)。圖3 TRPC6在正常腦組織和TSC病理組織中的表達

2.3.2 免疫熒光雙標結(jié)果表明，TRPC6陽性的MNs(包括GCs和DNs)與神經(jīng)元標記物NeuN、NF-200均存在共表達，TRPC6表達陽性的膠質(zhì)細胞與Vimentin共表達，但未觀察到TRPC6表達陽性的DNs及GCs與膠質(zhì)細胞標記物GFAP、Vimentin共表達。見圖4。

3 討 論

癲癇是多種病因引起的大腦神經(jīng)元突發(fā)性異常放電，并導(dǎo)致短暫的大腦功能障礙的一種慢性疾病。從神經(jīng)電生理角度看，癲癇發(fā)作指腦神經(jīng)元異常和過度超同步化放電所造成的臨床現(xiàn)象。臨床常用抗癲癇藥的主要作用靶點之一是針對選擇性離子通道研發(fā)的，而對于非選擇性離子通道的研究甚少。最近的研究[8]顯示，非選擇性陽離子通道的激活可使細胞膜持續(xù)去極化，參與簇狀放電、突觸傳遞和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多項生理功能。已有研究[9]指出，非選擇性離子通道參與一些神經(jīng)系統(tǒng)的疾病(如缺血性腦損傷、帕金森病等)的病理過程。

瞬時感受器電位(TRP)通道是位于細胞膜或胞內(nèi)細胞器膜上的一類非選擇性陽離子通道蛋白超家族，其中TRPC通道是TRP家族重要成員，包括TRPC1～7共7個亞型，其中TRPC2只表達于大鼠和小鼠，在人類是偽基因，TRPC通道在哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達，主要通透鈣離子、鈉離子和鎂離子。文獻[10]顯示，TRPC通道作為具有多種功能的細胞感受器，幾乎參與機體各系統(tǒng)眾多的基本生理過程，如參與受體介導(dǎo)的鈣依賴性分泌、調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞的分化、影響血管收縮、參與淋巴細胞免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)鈉鈣交換耦聯(lián)、誘導(dǎo)神經(jīng)元生長錐的方向、影響腦的發(fā)育、啟動血小板聚集等。

近年來的研究顯示，TRPC與BDNF的關(guān)系密切，Montell等[11]揭示了TRPC通道和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)存在上下游關(guān)系，BDNF/TRPC通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理及病理過程中的作用正逐步引起人們的廣泛重視。

目前的觀念認為，神經(jīng)元丟失、繼發(fā)性神經(jīng)發(fā)生(異常的神經(jīng)細胞增殖與分化)、突觸結(jié)構(gòu)重塑及異常的突觸傳遞是癲癇發(fā)生的主要病因?qū)W要素，據(jù)此，我們認為BDNF/TRPC通道的激活可能是TSC癲癇點燃過程的重要調(diào)控因素，主要依據(jù)：(1)Kim等[12]報道，BDNF受體TrkB高表達于FCD皮質(zhì)致癇灶中的異構(gòu)神經(jīng)元，而通過本研究發(fā)現(xiàn)TSC與FCD具有相同的病理特征，即在皮質(zhì)致癇灶中出現(xiàn)異構(gòu)神經(jīng)元，如DNs、GCs，并檢測到TRPC6在TSC的致癇灶中表達上調(diào)，且特異性高表達于異構(gòu)神經(jīng)元(細胞膜、細胞質(zhì)及突起均有表達)，因此表明BDNF/TRPC通路具有發(fā)揮其生物學功能的形態(tài)學基礎(chǔ)。(2)文獻[13-14]顯示，在哺乳動物發(fā)育的早期階段即可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)檢測到BDNF、TRPC的表達，BDNF、TRPC可通過多種途徑影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程。BDNF還可促進小腦顆粒細胞的遷移，通過激活TRPC通道調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長錐的生長方向。因此說明BDNF/TRPC通道具有影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生的功能學基礎(chǔ)。(3)BDNF/TRPC通道的激活可影響神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的興奮狀態(tài)，促進突觸結(jié)構(gòu)的重塑。Amaral等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在海馬CA1錐體神經(jīng)元上，BDNF通過TRPC的介導(dǎo)誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)向型陽離子電流IBDNF以維持神經(jīng)元處于去極化狀態(tài)，并通過此機制促進樹突棘數(shù)量的增加，重塑突觸結(jié)構(gòu)。文獻[14]指出，TRPC6通道在興奮性突觸，特別是突觸后大量表達，促進神經(jīng)元樹突棘密度增加。樹突棘是神經(jīng)元突起上的一種微小結(jié)構(gòu)，是形成興奮性突觸的重點位點。研究者發(fā)現(xiàn)，TRPC6通道的激活可促進興奮性突觸的形成，提高小鼠空間學習和記憶力。(4)BDNF/TRPC通道可調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的分泌，影響突觸的傳遞。BDNF通過激活TRPC引起細胞內(nèi)鈣離子濃度增高，繼而激發(fā)鈣依賴性分泌活動的發(fā)生。另一方面，一些興奮性神經(jīng)遞質(zhì)如谷氨酸，可直接誘導(dǎo)神經(jīng)元分泌BDNF的分泌，BDNF作用于突觸后膜的TrkB受體進而激活胞內(nèi)鈣庫的釋放及TRPC通道的激活，進一步促進神經(jīng)元分泌興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，從而引起整個神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的同步興奮。

在本研究中，我們利用Western blot、免疫組化及免疫熒光雙標實驗檢測到TRPC6在結(jié)節(jié)性硬化癥癲癇患者病灶皮層腦組織中表達上調(diào),并特異性高表達于異構(gòu)神經(jīng)元(可表達在異構(gòu)神經(jīng)元的胞膜、胞質(zhì)及突起)。因此，結(jié)合上述科學研究證據(jù)和本次研究的結(jié)果，我們大膽推測TRPC通道的異常表達及特異性的分布模式參與了TSC的致癇機制。

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Expression of TRPC6 in the cortical focus of patients with epilepsy from tuberous sclerosis complex

ZhaoYongpin1，YuSixun2,LiuWeimin1.

1.DepartmentofNeurology,TheFirstPeople'sHospital,Guiyang550002,Guizhou,China. 2.DepartmentofNeurosurgery,GeneralHospitalofChengduMilitaryRegion,Chengdu610000,Sichuan,China.

Objective To detect the expression of TRPC6 in the cortical lesions of patients with epilepsy from tuberous sclerosis complex. Methods 18 clinical cases of TSC and 7 cases of non-epileptic brain tissues were enrolled in our study, and the expression pattern of TRPC6 was observed by immunohistochemistry and western blot (WB) analysis. Results WB analysis result was showed that TRPC6 expression tended to be higher in TSC compared with CTX immunohistochemistry and immune fluorescent double labeling analysis showed that immune strength of TRPC6 tended to be higher in TSC compared with CTX and TRPC6 was moderate-strong expressed in misshapen cells, including dysmorphic neurons (DNs) and giant cells (GCs).Conclusion The increased expression of TRPC6 in epileptic cortex might be closely involved in the pathogenesis of intractable epilepsy.

TRPC6； Tuberous sclerosis complex； Epilepsy

R742.1

A

1000-744X(2016)10-1036-04

2016-02-29)