葉惠平 梁文卿 李芊芊 張安琪 吳哲丹 喻國凍

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻喉科,貴州 貴陽 550004)

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程序性死亡配體-1與白細(xì)胞介素-10在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

葉惠平 梁文卿 李芊芊 張安琪 吳哲丹 喻國凍

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻喉科,貴州 貴陽 550004)

目的 通過檢測(cè)程序性死亡配體-1(PD-L1)和白細(xì)胞介素-10(IL-10)在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，分析與喉鱗癌的腫瘤部位、病理分級(jí)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等之間的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組化二步法檢測(cè)30例喉鱗狀細(xì)胞癌組織(觀察組)和15例癌旁正常組織(對(duì)照組)中PD-L1及IL-10的表達(dá)情況，分析二者與喉鱗狀細(xì)胞癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系及二者表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果(1)PD-L1在喉鱗狀細(xì)胞癌組織(56.67%)中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(13.33%)；喉鱗狀細(xì)胞癌組織中PD-L1的陽性表達(dá)與病理分級(jí)、臨床分期(TNM分期)、T分期、腫瘤局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與腫瘤分區(qū)、患者年齡無明顯相關(guān)性。(2)IL-10在喉鱗狀細(xì)胞癌組織(63.33%)中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(20.00%)；喉鱗狀細(xì)胞癌組織中IL-10的陽性表達(dá)與TNM分期、T分期、腫瘤局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與病理分級(jí)、腫瘤分區(qū)、患者年齡無明顯相關(guān)性。(3)喉鱗狀細(xì)胞癌組織中PD-L1、IL-10的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.522，P<0.05)。結(jié)論(1)PD-L1與IL-10的高表達(dá)可能與喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病相關(guān)，兩者參與了腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移；(2)免疫卡控點(diǎn)的調(diào)控和抑制性細(xì)胞因子與腫瘤的免疫逃逸密切相關(guān)，PD-L1與IL-10在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)呈正相關(guān)，兩者可能協(xié)同參與喉鱗狀細(xì)胞癌的免疫逃逸；(3)聯(lián)合檢測(cè)PD-L1與IL-10在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)對(duì)喉鱗癌的臨床評(píng)估有一定價(jià)值；為喉鱗癌的免疫治療提供理論支持。

程序性死亡配體-1； 白細(xì)胞介素-10； 喉鱗狀細(xì)胞癌

喉癌為耳鼻咽喉頭頸外科常見惡性腫瘤，發(fā)病率約占全身惡性腫瘤的1%～5%，近年來喉癌的發(fā)病有明顯升高及年輕化趨勢(shì)[1]。晚期喉癌由于浸潤和轉(zhuǎn)移，治療效果較差，其5年生存率約在60%以下[2]。近十年來免疫卡控點(diǎn)的研究，通過調(diào)控機(jī)體T細(xì)胞的免疫治療，使轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的治療獲得重大突破[3]。本研究以PD-L1及IL-10為對(duì)象，探討相關(guān)免疫指標(biāo)在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)以及與喉鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理特征的相關(guān)性研究，為喉鱗狀細(xì)胞癌的免疫治療提供理論依據(jù)和思路。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本 選取貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科2014年11月至2015年11月,經(jīng)手術(shù)活檢后病理確診為喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本，且術(shù)前均未行其它治療。男29例，女1例，年齡46～76歲，平均(62.17±11.18)歲。聲門上型9例，聲門型16例，聲門下型2例，貫聲門型3例。低分化1例，中分化17例，高分化12例。同時(shí)記錄患者TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。喉癌組織和癌旁正常黏膜置于10%中性緩沖福爾馬林固定，包埋及免疫組化檢測(cè)。

1.2 試劑與方法 兔抗人PD-L1單克隆抗體(ZA-0629)及免疫組化試劑盒(PV-6001)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗人IL-10多克隆抗體(bS-0698)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。本實(shí)驗(yàn)采用非生物素二步法。

1.3 結(jié)果判斷 PD-L1和IL-10染色標(biāo)準(zhǔn)：本實(shí)驗(yàn)觀察到PD-Ll及IL-10陽性染色主要定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)無重復(fù)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞的比例，取其平均值。陽性細(xì)胞的百分比分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞≤10%為陰性(-)，陽性細(xì)胞數(shù)≤30%為弱陽性(+)，陽性細(xì)胞數(shù)≤60%為陽性(++)，陽性細(xì)胞數(shù)>60%為強(qiáng)陽性(+++)。統(tǒng)計(jì)時(shí)將(+ ) ～(+++)均作為表達(dá)陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間差異比較用χ2檢驗(yàn)，PD-L1與IL-10表達(dá)的相關(guān)性分析采用非參數(shù)Spearman秩相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PD-L1、IL-10在喉鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁正常組織中表達(dá) PD-L1陽性顯色表現(xiàn)呈棕黃色或棕褐色著色，喉鱗狀細(xì)胞癌組織中細(xì)胞膜和胞質(zhì)中棕黃色顆粒大量聚集，腫瘤細(xì)胞著色明顯(圖1a)，在部分正常組織中，亦發(fā)現(xiàn)PD-L1低表達(dá)，著色較淺，散在分布(圖1b)；IL-10陽性顯色為棕黃色或棕褐色(圖2a)，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜，以細(xì)胞質(zhì)表達(dá)為主(圖2b)。喉鱗狀細(xì)胞癌組織中PD-L1、IL-10的陽性表達(dá)率分別為56.67%(17/30)、63.33%(19/30)，顯著高于PD-L1、IL-10在正常組織中的表達(dá)(P<0.05)。

2.2 PD-L1和IL-10在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系 喉鱗狀細(xì)胞癌組織中PD-L1的陽性表達(dá)與病理分級(jí)、TNM分期、T分期、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，PD-L1在中低分化喉鱗癌組和Ⅲ、Ⅳ期患者組及T3、T4期患者組的陽性表達(dá)率顯著高于臨床分期早期患者組；局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組PD-L1的陽性表達(dá)率87.50%明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組45.45%。喉鱗狀細(xì)胞癌組織中IL-10陽性表達(dá)與TNM分期、T分期、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；IL-10在Ⅲ、Ⅳ期患者組、T3、T4期患者組、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽性表達(dá)率分別為75.00%、 73.68%、 100.00%，但與病理分級(jí)、腫瘤分區(qū)、患者年齡無明顯相關(guān)性。

2.3 PD-L1和IL-10在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)的相關(guān)性分析 PD-L1與IL-10在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman秩相關(guān)分析，二者表達(dá)呈正相關(guān)，即隨著PD-L1表達(dá)增加，IL-10高表達(dá)所占的比例升高(rs=0.522，P<0.05)。

3 討 論

免疫卡控點(diǎn)的調(diào)控受到雙向機(jī)制調(diào)節(jié)[4]，在T細(xì)胞與APC(抗原呈遞細(xì)胞)之間存在大量的配體受體結(jié)合的調(diào)控模式。這些細(xì)胞表面存在的受體和配體結(jié)合后，部分產(chǎn)生協(xié)調(diào)刺激信號(hào)，也有傳遞抑制信息。正常情況下，T細(xì)胞一旦出現(xiàn)活化，抑制信息往往會(huì)出現(xiàn)上調(diào)，避免對(duì)機(jī)體的過度攻擊。負(fù)調(diào)控途徑包括CTLA-4和CD80或CD60、PD-1和PDL-1、ICOS。其中程序性死亡受體-1，其最初是從凋亡的小鼠T細(xì)胞雜交瘤2B4.11克隆出來的[5]。PD-1可與其內(nèi)源性配體PD-L1(B7-H1)或PD-L2(B7-DC)結(jié)合。研究[6-7]表明腫瘤微環(huán)境中呈現(xiàn)高度免疫抑制的狀態(tài)，且已在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、黑色素瘤等多種癌癥的腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(TILs)中發(fā)現(xiàn)了PD-1的高表達(dá)，且PD-1的高表達(dá)與腫瘤的分級(jí)、大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等有相關(guān)性，說明PD-1在腫瘤發(fā)生中具有重要作用，在多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了PD-L1的高表達(dá)[8]。

本研究通過免疫組織化學(xué)染色顯示PD-L1在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞質(zhì)中，PD-L1在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織(P<0.05)，我們推測(cè)在喉鱗狀細(xì)胞癌微環(huán)境中，PD-L1分子與受體PD-1分子介導(dǎo)的信號(hào)通路是介導(dǎo)喉鱗狀細(xì)胞癌免疫逃逸的重要信號(hào)分子。PD-L1在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中異常高表達(dá)，與病理分級(jí)、TNM分期、T分期、腫瘤局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。PD-L1在中低分化喉鱗癌中的陽性表達(dá)高于高分化癌組織，隨著更晚期的腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而增加，說明PD-L1在喉鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)變化是構(gòu)成喉鱗癌細(xì)胞微環(huán)境的非常重要的因素，伴隨著喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病、惡性發(fā)展及轉(zhuǎn)移的整個(gè)病程。

IL-10是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中一種重要的免疫抑制因子。腫瘤細(xì)胞自身也可分泌大量IL-10。IL-10主要通過以下幾方面參與抑制機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)：一方面，IL-10抑制Th1分化和細(xì)胞因子的合成。機(jī)體的抗腫瘤免疫主要通過Th1亞群介導(dǎo)的細(xì)胞免疫來完成，IL-10通過抑制抗原提呈細(xì)胞表面MHC-Ⅱ類分子和協(xié)同刺激分子CD80和CD86的表達(dá)，從而抑制抗原提呈給T細(xì)胞的過程，間接實(shí)現(xiàn)對(duì)Th1細(xì)胞的抑制；同時(shí)，IL-10抑制樹突細(xì)胞產(chǎn)生Th1細(xì)胞分化所必需的細(xì)胞因子IL-12來抑制Th1的分化。另一方面，IL-10可以抑制CTL的增殖和細(xì)胞毒作用[9]?；罨腃TL的主要作用是作為免疫效應(yīng)分子誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，IL-10通過抑制Th1細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，從而抑制CTL的活化和分化；IL-10還可以抑制腫瘤細(xì)胞表面MHC-Ⅰ類抗原的表達(dá)，從而影響CTL對(duì)腫瘤抗原的識(shí)別，使腫瘤細(xì)胞逃避CTL的殺傷作用[10]。

本研究通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)到IL-10在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯高于其在正常組織中的表達(dá)，且IL-10的陽性表達(dá)與TNM分期、T分期、腫瘤局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，在更晚期腫瘤分期及有淋巴結(jié)浸潤的喉鱗癌組織中更易檢測(cè)到，這表明IL-10在喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起作用。Dulos等[11]發(fā)現(xiàn)PD-1能夠抑制CD4+T細(xì)胞向Th1亞群分化，而促進(jìn)其向Th2亞群分化。文獻(xiàn)[12-13]發(fā)現(xiàn)，PD-L1能夠增強(qiáng)Treg的功能，并且促進(jìn)Treg產(chǎn)生IL-10。結(jié)合本研究結(jié)果，喉鱗狀細(xì)胞癌組織中PD-L1與IL-10的表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)，兩者可能共同參與喉鱗狀細(xì)胞癌免疫逃避過程。

我們研究發(fā)現(xiàn)PD-L1與IL-10的高表達(dá)可能與喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病相關(guān)，促進(jìn)了腫瘤的惡性發(fā)展及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。免疫卡控點(diǎn)的調(diào)控和免疫抑制因子與腫瘤的免疫逃逸密切相關(guān)，PD-L1與IL-10在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)呈正相關(guān)，可能協(xié)同參與喉鱗狀細(xì)胞癌的免疫逃逸，為喉癌的免疫治療提供理論依據(jù)，調(diào)控喉鱗癌組織中的上述靶點(diǎn)，有望成為控制喉鱗狀細(xì)胞癌惡性發(fā)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的新途徑。

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Expression and Role of Programmed death-1 ligand and Interleukin-10 in Laryngeal Squamous Cell Carcinomas

YeHuiping,LiangWenqing,LiQianqian,ZhangAnqi,WuZhedan,Yuguodong.

DepartmentofEar-Nose-Throat,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China.

Objective To identify the relationship between the expression of programmed death-1 ligand (PD-L1) and interleukin-10 (IL-10) and the tumorous division, clinical stage, pathological grade and lymph node metastasis of LSCC.Methods The expression of PD-L1 and IL-10 were detected by two-step immunohistochemistry in thirty cases of LSCC tissues (experiment group) and fifteen cases of para-carcinoma tissues (control group), the correlation between them and their correlations with the clinicopathological parameters were analyzed. Results The levels of PD-L1 positive expression in LSCC tissue (56.67%) were significantly higher than that of histologically normal tissue (13.33%). In the LSCC tissues, the expression of PD-L1 was significantly associated with the pathological grade, T stage, TNM stage of LSCC and lymph node metastasis (P<0.05), but no association was observed with tumor sites and age of patients. The levels of IL-10 expression in LSCC tissue (63.33%) were significantly higher than that of histologically normal tissue (20.00%). In the LSCC tissues, the expression of PD-L1 was significantly associated with the T stage, TNM stage of LSCC and lymph node metastasis (P<0.05), but no association was observed with pathological grade, tumor sites and age of patients. The expression of PD-L1 pro-correlated with IL-10 in the LSCC tissues (r=0.522，P<0.05). Conclusion The high expression of PD-L1 and IL-10 may be closely related to the occurrence, development and metastasis of LSCC. The expression of PD-L1 pro-correlated with IL-10 in the LSCC tissues, they may be interactive with each other in the immune escape of LSCC together. Inhibition of their expression in LSCC might be a new treatment to LSCC.

Programmed death-1 ligand； Interleukin-10； Laryngeal squamous cell carcinomas

貴州省科技廳聯(lián)合基金項(xiàng)目資助(LG-2012-068);貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院博士啟動(dòng)基金資助

R739.65

A

1000-744X(2016)10-1019-03

2016-06-23)