曹 劍，黃志偉

（重慶三峽職業(yè)學(xué)院農(nóng)林科技系，重慶 404155）

正交試驗(yàn)優(yōu)選白及組培苗生根培養(yǎng)基

曹 劍，黃志偉

（重慶三峽職業(yè)學(xué)院農(nóng)林科技系，重慶 404155）

為優(yōu)化白及（Bletilla striata）組培苗生根技術(shù)體系，試驗(yàn)以1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用4因素3水平（L9（34））3次重復(fù)正交試驗(yàn)，研究NAA、GA3、6-BA及香蕉泥4因素不同組合對(duì)白及組培苗生根效果的影響。結(jié)果表明，4個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)白及生根的影響大小程度依次為NAA ＞ 香蕉泥 ＞ GA3＞ 6-BA，其中NAA、GA3及香蕉泥有促進(jìn)白及根系生長(zhǎng)的作用，6-BA則對(duì)白及生根有抑制作用；白及生根培養(yǎng)基的最適配方為：1/2MS+ NAA0.2 mg/L + GA30.5mg/L+香蕉泥30g/L；白及根系生長(zhǎng)曲線(xiàn)，總體呈慢—快—慢的“S”型增長(zhǎng)。

白及；組培苗；正交試驗(yàn)；生根培養(yǎng)；生長(zhǎng)曲線(xiàn)

白及（Bletilla striata）又名及白芨、連及草、白根、紫蕙等，為蘭科（Orchidaceae）白及屬（Bletilla）植物。白及最早被記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中，得名是因“其根白色，連及而生”。白及以干燥塊莖入藥，其藥性甘、苦、澀，性寒，歸肺、胃、肝經(jīng)，具有收斂止血，消腫生肌之效，主治體內(nèi)外諸出血癥，是具有相當(dāng)發(fā)展前景的藥用原料及生物醫(yī)學(xué)材料，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值不容忽視[1～2]。但白及種子較小，自然條件下需與真菌共生才能萌發(fā)，實(shí)生苗的栽培較為困難，而傳統(tǒng)分株等無(wú)性繁殖方式的繁殖系數(shù)極低。近年來(lái)，由于人為的過(guò)度采挖和天然生境的破壞，其野生資源急劇減少，瀕臨滅絕，被國(guó)家列為重點(diǎn)保護(hù)的野生藥用植物之一[3～4]。

目前，隨著國(guó)內(nèi)越來(lái)越多的企業(yè)及種植戶(hù)加入到白及生產(chǎn)行列，白及種苗的需求量迅速增加，組培苗以其高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、整齊劃一等優(yōu)良特性已被廣大種植者爭(zhēng)相采用，逐漸取代了傳統(tǒng)的分株繁殖方式。然而在長(zhǎng)期增殖過(guò)程中存在一部分弱苗、玻璃化苗，影響正常的繼代擴(kuò)繁，降低了生根率與移栽緩苗成活率，繼而降低種苗品質(zhì)，嚴(yán)重影響正常的工廠(chǎng)化生產(chǎn)與效益。因此，提高白及組培苗生根壯苗的比率是保證白及正常工廠(chǎng)化生產(chǎn)與銷(xiāo)售的前提。有關(guān)白及組織培養(yǎng)技術(shù)方面的研究報(bào)道已有很多[5～7]，但至今未見(jiàn)對(duì)白及組培苗生根壯苗培育的詳細(xì)研究。本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，研究了NAA、GA3、6-BA和香蕉泥4個(gè)因素對(duì)白及組培苗生根壯苗培育的影響，旨在探索不同組合下白及組培苗生根壯苗的生長(zhǎng)規(guī)律，建立白及生根壯苗的優(yōu)化生產(chǎn)工藝，為工廠(chǎng)化大規(guī)模生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)白及種苗提供理論依據(jù)與技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)材料來(lái)自重慶市藥用植物研究所，在其開(kāi)花授粉后15周以上時(shí)采集尚未開(kāi)裂的成熟蒴果作為白及種子來(lái)源。

1.2 方法

1.2.1 無(wú)菌苗的培育 無(wú)菌苗的培育于2014年8月在重慶三峽職業(yè)學(xué)院組培實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。選取白及成熟蒴果在無(wú)菌條件下播種，培養(yǎng)基為1/2 MS＋6-BA 0.5 mg/L＋10%椰子汁＋活性炭0.4 g/L，其中添加30 g/L蔗糖、5 g/L瓊脂粉，pH值調(diào)節(jié)至5.8，培養(yǎng)溫度為（25±1）℃、光照強(qiáng)度2 000 ～ 2 500 lx、光照時(shí)間12 h/d。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以NAA（A）、GA3（B）、6-BA（C）、香蕉泥（D）為因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，得到L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表（表1）。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)步驟及培養(yǎng)條件 選取同一批次、長(zhǎng)勢(shì)一致的白及組培苗，要求苗高在1.0 ～ 1.5 cm (原球莖頂端至新葉抽生出的垂直高度)，仔細(xì)去除下部黃葉及原球莖上已有根系。直接插入表1試驗(yàn)培養(yǎng)基中（30 g/L蔗糖，5 g/L瓊脂粉，pH 5.8），每處理20瓶，每瓶10株苗。培養(yǎng)溫度為(25±1)℃、光照強(qiáng)度2 000 ～ 2 500 lx、光照時(shí)間12 h／d。

1.2.4 結(jié)果記錄及數(shù)據(jù)處理 記錄白及組培苗生根情況，每隔10 d采集1次數(shù)據(jù)，連續(xù)記錄6次。每次每處理隨機(jī)抽取3瓶，采集組培苗生根數(shù)、根長(zhǎng)、根粗、有無(wú)畸形根及畸形苗等數(shù)據(jù)，并綜合評(píng)價(jià)生根質(zhì)量。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用Min-max標(biāo)準(zhǔn)化法。

根據(jù)苑玉鳳[8]的多指標(biāo)正交試驗(yàn)分析方法，采用公式評(píng)分法對(duì)幾個(gè)主要生根指標(biāo)打分后進(jìn)行極差與方差分析，其中平均生根數(shù)最為重要，以5倍計(jì)算，即權(quán)數(shù)為5；其次為根系總長(zhǎng)，以3倍計(jì)算，即權(quán)數(shù)為3；根系直徑以2倍計(jì)算，即權(quán)數(shù)為2；故其評(píng)分公式為：綜合評(píng)分為5倍平均根數(shù)、3倍根系總長(zhǎng)與2倍根系直徑之和。

根系總長(zhǎng)為一株組培苗所有根系的總長(zhǎng)度，根系直徑為一株組培苗平均根粗，對(duì)各處理指標(biāo)采用公式評(píng)分法進(jìn)行評(píng)價(jià)，綜合評(píng)分越高的，說(shuō)明生根效果越好。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel和DPS7.05軟件進(jìn)行分析。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9（34）Table 1 Orthogonal design

2 結(jié)果與分析

2.1 激素種類(lèi)、濃度及香蕉泥濃度對(duì)白及生根的綜合影響

利用轉(zhuǎn)接培養(yǎng)30 d的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可以看出，在組合條件下，8號(hào)處理即1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L＋GA30.5 mg/L＋香蕉泥40 g/L，不添加6-BA，誘導(dǎo)生根情況好，平均根數(shù)達(dá)到4.41條；9號(hào)處理1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L＋GA31.0 mg/L＋6-BA 0.2 mg/L，根系直徑最粗，達(dá)1.46 mm；而6號(hào)處理1/2 MS＋NAA 0.2 mg/L＋GA31.0 mg/L＋香蕉泥20 g/L，單株根系總長(zhǎng)高達(dá)5.10 cm，根生長(zhǎng)表現(xiàn)最好。

利用上述標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)以及綜合評(píng)分公式做極差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可看出，各因素作用的主次順序?yàn)锳 ＞ D ＞ B ＞ C，即NAA對(duì)白及組培苗生根起主導(dǎo)作用，其次是香蕉泥濃度，然后是GA3，而6-BA則對(duì)白及苗生根有一定抑制作用。

表2 激素種類(lèi)、濃度及香蕉泥濃度對(duì)白及組培苗生根的影響Table 2 Effect of different hormones and concentration and mashed banana concentration on rooting of tissue culture seedling

表3 L9（34）正交試驗(yàn)的極差分析Table 3 Range analysis on orthogonal experiment

進(jìn)一步作方差分析，以判斷各個(gè)因素對(duì)白及組培苗生根的影響程度，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可以看出，4個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響均達(dá)到了極顯著水平。用LSD法進(jìn)行多重比較（表3）。A因素NAA 3個(gè)濃度對(duì)白及組培苗生根綜合影響達(dá)顯著水平；B因素GA3濃度0.5 mg/L與1.0 mg/L差異不顯著，而前兩者又與不添加GA3差異顯著；C因素6-BA當(dāng)濃度為0時(shí)與其余兩濃度差異顯著，而0.2 mg/L與0.5 mg/L差異不顯著；D因素香蕉泥的3個(gè)濃度之間達(dá)顯著水平。

表4 L9（34）白及組培苗生根培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的方差分析Table 4 ANOVA on orthogonal experiment

通過(guò)分析，理論上得出白及組培苗生根培養(yǎng)的最優(yōu)組合為A3B3C1D2，即1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L＋ GA31.0mg/L +香蕉泥30 g/L，但是，在觀察中我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NAA濃度增加到0.5 mg/L時(shí)，白及苗出現(xiàn)叢生芽及畸形根現(xiàn)象，所以NAA的優(yōu)水平應(yīng)為A2，即NAA濃度為0.2 mg/L；而GA3濃度0.5 mg/L與1.0 mg/L差異不顯著，本著節(jié)約成本的角度考慮，其優(yōu)水平可以為B2，那么經(jīng)過(guò)修正后的組合為A2B2C1D2，即1/2 MS＋NAA0.2 mg/L＋GA30.5 mg/L＋香蕉泥30g/L。

2.2 白及組培苗根系生長(zhǎng)曲線(xiàn)

篩選生根綜合評(píng)分前三的處理，即8號(hào)、6號(hào)及9號(hào)處理，記錄白及苗總根長(zhǎng)數(shù)據(jù)（表5）并繪制根系生長(zhǎng)曲線(xiàn)。由表1可以看出，白及組培苗根系生長(zhǎng)情況大致分成3個(gè)階段，第一階段為從轉(zhuǎn)接開(kāi)始到轉(zhuǎn)接20 d，白及苗需經(jīng)過(guò)適應(yīng)新培養(yǎng)基以及根系萌發(fā)過(guò)程，此階段根系伸長(zhǎng)生長(zhǎng)緩慢；第二階段為轉(zhuǎn)接20 ～ 40 d，由于白及已經(jīng)充分適應(yīng)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，根系能夠快速生長(zhǎng)，是根系快速伸長(zhǎng)生長(zhǎng)階段；第三階段為轉(zhuǎn)接40 ～ 60 d，由于前期白及苗的快速生長(zhǎng)消耗了較多的營(yíng)養(yǎng)成分，此時(shí)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分也已較少，加之由于白及苗根系的快速生長(zhǎng)導(dǎo)致生長(zhǎng)空間的競(jìng)爭(zhēng)，所以此階段根系的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)明顯減慢。

表5 白及組培苗總根長(zhǎng)Table 5 Total root length of tissue culture seedlingcm

3 結(jié)論與討論

在白及組培苗的生根培養(yǎng)過(guò)程中，NAA、GA3及香蕉泥有促進(jìn)白及根系生長(zhǎng)的作用，其中NAA起到主導(dǎo)作用，但NAA濃度達(dá)0.5 mg/L時(shí)，7號(hào)、8號(hào)及9號(hào)處理出現(xiàn)畸形根及叢生芽，不利于培育優(yōu)質(zhì)壯苗，而6-BA則相反，對(duì)白及根系生長(zhǎng)有抑制作用，這與付志惠等[6]、趙漫麗等[9]的研究結(jié)果不盡相同，其原因還有待進(jìn)一步研究。此次試驗(yàn)得出白及生根培養(yǎng)的最適配方為：1/2 MS＋NAA 0.2 mg/L＋GA30.5 mg/L＋香蕉泥30 g/L。

觀察中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)接60 d時(shí)，瓶苗之間的根系已經(jīng)糾結(jié)在一起，難以分離開(kāi)來(lái)，或者即便能分離開(kāi)也會(huì)有部分根系在分離過(guò)程中受傷或折斷等現(xiàn)象發(fā)生。因此，建議生產(chǎn)上為確保煉苗移植時(shí)白及苗根系的完好，應(yīng)隨時(shí)觀察根系的生長(zhǎng)情況，當(dāng)開(kāi)始出現(xiàn)根系打結(jié)時(shí)，就應(yīng)立即煉苗移栽。在實(shí)際生產(chǎn)中，還應(yīng)注意轉(zhuǎn)接苗密度設(shè)置、培養(yǎng)基灌裝量大小對(duì)組培苗綜合生長(zhǎng)的影響，具體機(jī)理也有待進(jìn)一步研究。

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Orthogonal Experiment on Medium for Tissue Culture Bletilla striata Seedling Rooting

CAO Jian，HUANG Zhi-wei

（School of Agroforestry, Chongqing Three Gorges Vocational College, Chongqing 404155, China）

Orthogonal experiments were conducted on effect of different concentration and combination of NAA, GA3, 6-BA and mashed banana in 1/2MS on rooting of tissue culture Bletilla striata seedling. The results showed that NAA, mashed banana and GA3could promote growth of root system, while 6-BA had inhibitory effect on rooting. The optimal medium for rooting was 1/2MS + 0.2 mg/L NAA + 0.5mg/L GA3+ 30g/L mashed banana. Root growth curve of tissue culture Bletilla Striata seedling was "S" type.

Bletilla Striata; tissue culture seedling; orthogonal test; rooting

S567.23

A

1001-3776（2016）01-0047-04

2015-08-21；

2015-11-02

重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目白及組培育苗技術(shù)條件優(yōu)化研究（KJ1403309）

曹劍（1978－），女，碩士，從事有害生物防控、特種作物栽培；*通訊作者。