摘要:建立枸杞子OTA污染的檢測方法,分別用100 mL甲醇-0.1 mol/L正磷酸(10∶1)溶液、5% NaHCO3-1% PEG 8 000溶液、甲醇-水(4∶1)溶液、2% NaHCO3-15% NaCl溶液等4種溶液提取寧夏枸杞子中OTA;取20 mL提取液過固相萃取柱(SPE),再用0.1 mol/L磷酸、雙蒸水淋洗,乙酸乙酯洗脫后氮?dú)獯蹈桑鲃?dòng)相溶解;高效液相色譜法測定,條件為C18反相柱分離,乙腈-水-乙酸(99∶99∶2)為流動(dòng)相,熒光檢測器(激發(fā)波長330 nm,發(fā)射波長460 nm)檢測。結(jié)果表明,5% NaHCO3+1% PEG 8 000溶液為最佳提取液,SPE柱純化后,HPLC測定,平均回收率為88.6%~118.0%,變異系數(shù)為3.16%~7.54%,可以作為檢測寧夏枸杞子中OTA污染的方法。
關(guān)鍵詞:寧夏枸杞(Lycium barbarum L.);赭曲霉毒素A;固相萃取
中圖分類號:R282 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:0439-8114(2016)14-3733-04
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.14.049
Abstract:The method of determination OTA in wolfberry with SPE-HPLC was established in this paper. The dried wolfberry was grinded and extracted Ochratoxin A with methyl alcohol-0.1 mol/L phosphoric acid(10∶1),5% NaHCO3-1% PEG 8 000,methyl alcohol-water (4∶1) and 2% NaHCO3-15% NaCl. After C18 solid phase extraction column (C18-SPE) has activated with 5 mL Methanol,5 mL double diluted water, 5 mL Sodium hydrogen carbonate(30 g/L),the above extract 20 mL was firstly brought into C18-SPE column. Then the C18-SPE column was washed with 2 mL phosphoric acid (0.1 mol/L) and 2 mL double diluted water respectively and was eluted with 5 mL ethyl acetate subsequently. The eluent was dried with N2 gas. The residue was dissolved with 0.2 mL of mobile phase for determination. The chromatographic column was C18 reversed-phase column(150 mm×4.6 mm i.d.) for separation. Mobile phase was acetonitrile-water-acetic acid(99∶99∶2). A high performance liquid chromatography determined with fluorescence detection. The excitation wavelength is 330 nm. The emission wavelength is 460 nm.The recoveries of this method were between 88.6% and 118.0%,and coefficient of variation varied from 3.16% to 7.54%. This method can be used to detection OTA in wolfberry.
Key words:Ningxia wolfberry(Lycium barbarum L.);Ochratoxin A;solid-phase extraction
赭曲霉毒素(Ochratoxin)是一類結(jié)構(gòu)相似的生物毒素,有OTA、OTB、OTC、OTD 4種化合物,其中OTA毒性最強(qiáng)、分布最廣、污染最嚴(yán)重,國際癌癥研究機(jī)構(gòu)IARC將其確定為2B類致癌物[1]。OTA的分子質(zhì)量為403.8,熔點(diǎn)169 ℃,為無色晶體,易溶于極性有機(jī)溶劑和稀碳酸氫鈉溶液,微溶于水,在紫外光下OTA呈綠色熒光,最大吸收峰為333 nm[2]。OTA由許多霉菌產(chǎn)生,主要有炭黑曲霉(Aspergillum carbonarius)、黑曲霉(A.niger)、棘孢曲霉(A.aculeatus)、塔賓曲霉(A.tubingensis)和青霉(Penicillium spp.),這些微生物平時(shí)存在于種植園土壤及殘葉上,其中一種或幾種在果實(shí)期轉(zhuǎn)為果棲微生物并產(chǎn)生毒素,積累在干果中或隨果粒榨汁進(jìn)入發(fā)酵過程。果酒、干果食品中OTA相當(dāng)穩(wěn)定,一般的烹調(diào)和加工方法只能部分破壞[3,4]。OTA的污染在全球范圍內(nèi)都比較嚴(yán)重,不僅在糧谷類(主要是小麥、大麥、玉米和燕麥)、豆類、花生、動(dòng)物飼料、葡萄、可可、咖啡豆等干果中發(fā)現(xiàn)OTA污染,而且在香料、茶葉、調(diào)味料、咖啡、巧克力、中草藥、罐頭食品、油、豆制品、啤酒、葡萄酒、葡萄汁等飲料中也已經(jīng)檢測到了OTA,甚至在以糧食為飼料動(dòng)物體內(nèi)及其肉、奶和奶制品等動(dòng)物性食品中也常有被OTA檢出,通過食物鏈蓄積對人類健康構(gòu)成威脅[5,6]。
枸杞子是由寧夏枸杞(Lycium barbarum L.)鮮果干燥制成的干果,由于其鮮果為漿果,含水率高,且表皮有蠟質(zhì)層覆蓋。因此,制干時(shí)間需要較長,致使其易生霉變,采摘后的枸杞鮮果不經(jīng)任何處理,1 d后就會有霉菌生長,2 d后霉變率為30%~40%,3 d后則高達(dá)50%~80%。采用太陽能干燥裝置干燥枸杞,其平均霉變率也在20%左右。在霉變過程中,炭黑曲霉、黑曲霉、塔賓曲霉和青霉這些產(chǎn)OTA的菌就有可能生長繁殖并產(chǎn)生OTA毒素[7,8]。目前,關(guān)于枸杞子中OTA污染的研究鮮見報(bào)道,有必要開展關(guān)于枸杞OTA污染狀況的研究。本研究以采用有機(jī)溶劑或碳酸氫鈉等溶液為提取液提取寧夏枸杞中的OTA,再用固相萃取柱(SPE)進(jìn)一步凈化,最后以高效液相色譜(HPLC)檢測OTA,摸索一種簡便高效的測定寧夏枸杞中OTA含量的方法,為寧夏枸杞安全生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料
枸杞子,購自寧夏銀川市同心路市場。
1.2 儀器
固相萃取裝置、C18-SPE柱(6 mL 500 mg)(美國Varian公司);高效液相色譜儀(Agilent Technologies 1200Series,美國Agilent公司);熒光檢測器(Agilent Technologies 1200 Series)、C18反相柱(pH 2~12)(美國Agilent公司);微量移液槍(德國Eppendorf公司)。
1.3 試劑
OTA標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99%,美國Fermentek公司);乙腈和甲醇(色譜純,天津市大茂化學(xué)試劑廠);其他試劑均為化學(xué)純。
OTA標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制:1 mg OTA 標(biāo)準(zhǔn)品用色譜級甲醇完全溶解,定容至 50 mL(20 μg/mL,-20 ℃避光保存)。
OTA標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制:取0.5 mL OTA 標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用流動(dòng)相定容至 100 mL(100 ng/mL,4 ℃避光保存)。
1.4 方法
1.4.1 樣品準(zhǔn)備 稱取枸杞子5 g,加入OTA標(biāo)準(zhǔn)品溶液(1 μg/mL),放入平皿,置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥12 h,粉碎機(jī)粉碎,使70%以上的樣品顆粒直徑在1 mm以下。
1.4.2 提取 粉碎枸杞子粉末中分別加入100 mL以下提取液:甲醇-0.1 mol/L正磷酸(10∶1)溶液、5% NaHCO3-1% PEG 8 000溶液、甲醇-水(4∶1)溶液、2% NaHCO3-15% NaCl溶液,磁力攪拌30 min, 15 000 r/min離心10 min,上清液用玻璃纖維濾紙過濾,取20 mL濾液上樣。
1.4.3 凈化方法 C18-SPE凈化方法,參考文獻(xiàn)[9-11]等方法。①C18-SPE萃取柱活化。C18-SPE柱依次用5 mL甲醇、5 mL超純水、5 mL 30 g/L碳酸氫鈉溶液沖洗小柱,保持柱子濕潤。②上樣。當(dāng)碳酸氫鈉溶液下降到柱底時(shí),立即將20 mL上樣液移入小柱。③淋洗。先用2 mL 0.1 mol/L磷酸淋洗,再用 2 mL超純水淋洗。④洗脫。用5 mL乙酸乙酯洗脫。用移液槍準(zhǔn)確移取1 mL乙酸乙酯洗脫液到樣品瓶中,氮?dú)獯蹈?。?.2 mL色譜流動(dòng)相溶解殘留物,經(jīng)0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾至樣液瓶內(nèi),供HPLC檢測。
1.4.4 HPLC檢測 色譜條件:參考AOAC2001方法[12,13]。色譜柱:C18反相柱(Eclipse XDB-C18分析柱,5 μm,4.6 mm×150 mm);流動(dòng)相∶乙腈;超純水∶冰乙酸=99∶99∶2,pH 3.2;流速:1.0 mL/min;熒光檢測條件:激發(fā)波長330 nm,發(fā)射波長460 nm;進(jìn)樣量:20 μL。
1.4.5 指標(biāo)計(jì)算 加標(biāo)回收率=(加標(biāo)樣品測定值-空白樣品測定值)/理論加標(biāo)濃度×100%;
式中,X—樣品中OTA含量,ng/g;A—樣液 OTA峰面積;Am—標(biāo)準(zhǔn)液OTA峰面積;C—標(biāo)準(zhǔn)液OTA的濃度,ng/mL;V—處理后的最終樣液體積,mL;M—最終樣液相當(dāng)?shù)脑嚇淤|(zhì)量,g。
2 結(jié)果與分析
2.1 線性范圍和檢測限
取OTA標(biāo)準(zhǔn)儲備液(20 μg/mL),用流動(dòng)相為溶劑,分別配制濃度為2、3、5、10、20、60、80 ng/mL的OTA標(biāo)準(zhǔn)液,按高效液相色譜法條件進(jìn)行檢測,每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)濃度分別檢測5次。以O(shè)TA質(zhì)量濃度y(ng/mL)對峰面積x進(jìn)行回歸分析,線性方程為y=1.311 4x+0.286 3,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 0。結(jié)果表明,OTA在2.0~80.0 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(圖1),OTA標(biāo)品的保留時(shí)間為7.023 min(圖2)。
2.2 不同提取溶液提取測定結(jié)果比較
稱取寧夏枸杞子5 g,加入OTA標(biāo)準(zhǔn)工作液(1 μg/mL)10 μL,分別用4種提取液提取,SPE柱凈化,HPLC檢測,重復(fù)3次,結(jié)果見表1。5%NaHCO3-1% PEG 8 000溶液色譜圖見圖3。以5% NaHCO3-1% PEG 8 000溶液作為提取液回收率最高,達(dá)88.7%,而以其他3種溶液為提取液的方法回收率在30%~67%,均未達(dá)到加標(biāo)回收率達(dá)到85%~105%的要求。因此,采用5% NaHCO3-1% PEG 8 000溶液為提取液。
2.3 回收率及精密度試驗(yàn)
制備加標(biāo)濃度為2 ng/g的加標(biāo)樣品,5% NaHCO3-1% PEG 8 000提取,SPE凈化,HPLC檢測,重復(fù)3次。結(jié)果表明,OTA的平均回收率為88.7%,標(biāo)準(zhǔn)差為3.58,變異系數(shù)為4.04%(表2),該方法的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性符合要求。
2.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)
分別制備加標(biāo)濃度為0.5、1、2、3 ng/g的加標(biāo)樣品,5% NaHCO3+1% PEG 8 000提取,SPE凈化,HPLC檢測,重復(fù)3次。結(jié)果表明,回收率為 88.6%~118.0%,變異系數(shù)為3.16%~7.54%(表3),說明該方法的回收率高,其準(zhǔn)確度能滿足要求。
3 討論
提取是OTA檢測中重要步驟,可以依據(jù)其理化性質(zhì)選用不同的提取劑,由于OTA易溶于極性有機(jī)試劑和稀碳酸氫鈉溶液性質(zhì),通常選用有機(jī)溶劑與酸性溶液(磷酸、乙酸或檸檬酸等)或碳酸氫鈉溶液的混合提取系統(tǒng)。本試驗(yàn)選取甲醇-0.1 mol/L正磷酸(10∶1)溶液、5% NaHCO3-1% PEG 8 000溶液、甲醇-水(4∶1)溶液、2% NaHCO3-15% NaCl溶液4種提取液,其中以5% NaHCO3-1% PEG 8 000溶液作為提取液回收率最高,達(dá)88.7%,而以其他3種溶液為提取液的方法回收率在30%~67%,均未達(dá)到加標(biāo)回收率為85%~105%的要求。由于枸杞中含有大量色素和芳香物質(zhì),這些物質(zhì)易溶于甲醇,可能出現(xiàn)乳化現(xiàn)象,致使甲醇-0.1 mol/L正磷酸(10∶1)溶液、甲醇-水(4∶1)溶液提取效率較低[14-17]。提取液中加入NaCl起到使溶液保持足夠電解質(zhì)離子強(qiáng)度,增加提取效率[18-21],但本試驗(yàn)中采用2% NaHCO3-15% NaCl溶液作為提取液結(jié)果并不理想,可能由于枸杞含多糖量較高,與高離子濃度的NaCl作用,使提取液中出現(xiàn)呈現(xiàn)粉狀,不易過濾,導(dǎo)致OTA殘留在殘?jiān)?,降低提取效率。而提取?% NaHCO3-1% PEG 8 000溶液中加入分子質(zhì)量8 000的聚乙二醇作為助濾劑使用,聚乙二醇較難溶解于水,不溶于甲醇,在進(jìn)行均質(zhì)并過濾時(shí),可以有效地增加樣品顆粒的間隙,提高過濾效率[15,16],獲得了88.7%的回收率,但回收率仍有優(yōu)化的空間,在后續(xù)試驗(yàn)中可采用磷酸/鹽酸化氯仿、氯仿、二氯甲烷,可能更進(jìn)一步提高回收率[22]。
凈化也是OTA檢測中另一重要步驟,近年來免疫親和層析柱(Immuno-affinity chromatography, IAC)由于凈化效果好已被廣泛使用,SPE柱與免疫親和柱相比,使用的有機(jī)試劑較少,對環(huán)境和試驗(yàn)人員的危害較小,價(jià)格相對便宜,被優(yōu)先使用[21]。本試驗(yàn)采用C18-SPE柱獲得了88.6%~118.0%回收率。但由于SPE柱對樣品中OTA的作用力為非特異性吸附力,加上枸杞子中含有豐富的枸杞多糖、單糖、色素等化合物,因此在保證較高回收率的同時(shí)凈化純度可能就不太理想,從加標(biāo)樣的色譜圖中就可以反映出這一點(diǎn),在精度要求更高試驗(yàn)中可以采用 IAC柱來提高凈化程度[23]。
4 結(jié)論
5% NaHCO3-1% PEG 8 000溶液作為提取液提取枸杞子中的OTA,再用固相萃取柱(SPE)進(jìn)一步凈化,最后以高效液相色譜(HPLC)檢測,平均回收率為88.6%~118.0%,變異系數(shù)為3.16%~7.54%,是一種測定枸杞子中OTA污染較為可靠的方法。
參考文獻(xiàn):
[1] 丁建英,韓劍眾.赭曲霉毒素A的研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā),2006,27(3):112-115.
[2] 高 翔,李 梅,張立實(shí).赭曲霉毒素A的毒性研究進(jìn)展[J]. 國外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊),2005,32(1):51-55.
[3] LEONG S L,HOCKING A D,PITT J I. Occurrence of fruit rot fungi(Aspergillus section Nigri) on some drying varieties of irrigated grapes[J]. Australian Journal of Grape and Wine Research,2008,10(1):83-88.
[4] RATOLA N,ABADE E,SIM?魸ES T,et al. Evolution of ochratoxin A content from must to wine in Port Wine Microvinification[J]. Analytical and bioanalytical chemistry,2005,382(2):405-41.
[5] 談敦芳.我國6省區(qū)糧谷類食品中赭曲霉毒素A污染水平調(diào)查與我國居民膳食暴露評估的研究[D].石家莊:河北醫(yī)科大學(xué),2006.
[6] ROUSSEAU J.Ochratoxin A in wines: Current knowledge.Vinidea.net[J].Wine Internet Technical Journal,2004,8(5):359-620.
[7] 杜 靜.枸杞表皮蠟質(zhì)及制干技術(shù)研究[D].蘭州:蘭州理工大學(xué),2010.
[8] 吳古飛.枸杞干燥過程中防霉劑的開發(fā)與應(yīng)用研究[D].蘭州:蘭州理工大學(xué),2011.
[9] 劉建利,林 勤,王甜甜,等.一種測定釀酒葡萄中赭曲霉毒素A的新方法[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2013,39(9):175-179.
[10] 李倩倩.葡萄酒與葡萄籽超微粉中赭曲霉毒素A提取及檢測方法的研究[D].陜西楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2009.
[11] 謝春梅,李倩倩,王 華. 固相萃取法萃取葡萄酒中赭曲霉毒素A的方法研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2008,36(12):187-191.
[12] VISCONTI A,PASCALE M,CENTONZE G. Determination of ochratoxin a in wine and beer by immunoaffinity column cleanup and liquid chromatographic analysis with fluorometric detection:Collaborative study[J].Journal of AOAC International,2001,84(6):1818-1827.
[13] ARESTA A,VATINNO R,PALMISANO F,et al. Determination of Ochratoxin A in wine at sub ng/mL levels by solid-phase microextraction coupled to liquid chromatography with fluorescence detection[J].Journal of Chromatography A,2006,1115(1):196-201.
[14] 呂相征,謝 妮,李業(yè)鵬,等.用高效液相色譜法測定糧食樣品中的赭曲霉毒素A[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2002,31(4):285-286.
[15] SERRA R,MENDONCA C,ABRUNHOSA L,et al. Determination of ochratoxin A in wine grapes: Comparison of extraction procedures and method validation[J].Analytica Chimica Acta, 2004,513(1):41-47.
[16] 褚慶華,郭德華,王 敏,等.谷物和酒類中赭曲霉毒素A的測定[J].中國國境衛(wèi)生檢疫雜志,2006,29(2):109-117.
[17] MEDINA A,MATEO R,L PEZ-OCAA L,et al.Study of Spanish grape mycobiota and ochratoxin A production by isolates of Aspergillus tubingensis and other members of Aspergillus section Nigri[J].Applied and Environmental Microbiology,2005, 71(8):4696-4702.
[18] 孫林超.免疫親和柱-高效液相色譜在白酒赭曲霉毒素A檢測中的應(yīng)用[J].釀酒科技,2009(3):113-115.
[19] 樊 祥,褚慶華,周 瑤,等.液-液萃取結(jié)合免疫親和柱層析凈化-高效液相色譜測定烘焙咖啡中赭曲霉毒素A[J].理化檢驗(yàn)(化學(xué)分冊),2008,44(8):736-739.
[20] TIMPERIO A M,MAGRO P,CHILOSI G,et al.Assay of ochratoxin A in grape by high-pressure liquid chromatography coupled on line with an ESI-mass spectrometry[J].Journal of Chromatography B,2006,832(1):127-133.
[21] ARESTA A,VATINNO R,PALMISANo F,et al. Determination of Ochratoxin A in wine at sub ng/mL levels by solid-phase microextraction coupled to liquid chromatography with fluorescence detection[J].Journal of Chromatography A,2006,1115(1):196-201.
[22] LO CURTO R,PELLICANO T,VILASI F,et al. Ochratoxin A occurrence in experimental wines in relationship with different pesticide treatments on grapes[J].Food Chemistry,2004,84(1):71-75.
[23] 楊 蕾.中藥中儲曲霉毒素A的檢測方法研究[D].北京:北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,2010.