摘要：為優(yōu)化微波輔助酶法提取白花蛇舌草（Hedyotis diffusa）總黃酮工藝，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，應(yīng)用中心組合設(shè)計(jì)，采用二次多項(xiàng)式逐步回歸分析方法對(duì)提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定微波輔助酶法提取白花蛇舌草總黃酮工藝最佳條件為酶解時(shí)間1.5 h、酶解溫度45 ℃、酶用量1.4%、pH 5.5，按此工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證，白花蛇舌草總黃酮提取率可達(dá)4.42%。

關(guān)鍵詞：白花蛇舌草（Hedyotis diffusa）；總黃酮；微波輔助；酶法

中圖分類號(hào)：S567.21+9；R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）14-3708-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.14.042

Abstract：Microwave-assisted enzymetic extraction of total flavonoids in Hedyotis diffusa Willd. was studied by using single factor experiment and central composite design combining quadratic polynomial stepwise regression analysis. It was concluded that the optimal conditions of extraction were： enzymolysis time 1.5 h，enzymolysis temperature 45 ℃，enzyme dosage 1.4% and pH 5.5. Under these conditions， the yield of total flavonoids in Hedyotis diffusa Willd was up to 4.42%.

Key words： Hedyotis diffusa； total flavonoids； microwave-assisted； enzymetic method

白花蛇舌草為茜草科植物白花蛇舌草（Hedyotis diffusa）的干燥全草，廣泛分布于中國(guó)東南和西南各省，具有清熱解毒、消痛散結(jié)、利濕除濕之功效，尤善治療各種類型炎癥，是民間常用中草藥[1]。白花蛇舌草中含大量生物活性物質(zhì)，如黃酮類、有機(jī)酸及其酯類、蒽醌類、萜類等成分[2]，其中黃酮類是其主要的藥效成分，具有抗菌抗炎、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)、抗腫瘤、抗化學(xué)誘變等作用[3，4]，并在臨床上得到了廣泛應(yīng)用[5，6]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，白花蛇舌草中黃酮類化合物的提取方法主要有微波輔助法[7，8]、超聲提取法[9]及醇提熱回流法[10]等，關(guān)于用微波輔助聯(lián)合酶法提取白花蛇舌草總黃酮的方法尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，使用響應(yīng)面分析法優(yōu)化白花蛇舌草總黃酮的提取工藝，為白花蛇舌草總黃酮的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

白花蛇舌草藥材購(gòu)自贛州市丁氏草藥店，經(jīng)贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥鑒定教研室程齊來(lái)教授鑒定。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（含量≥98%，天津一方科技有限公司）；纖維素酶（3×104 μ/g，江蘇淮安百麥綠色生物能源有限公司）；無(wú)水乙醇、石油醚、鹽酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁均為分析純。

UV-6100PCS型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；SHA-C型水浴恒溫振蕩器（金壇市白塔新寶儀器廠）；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市城東新瑞儀器廠）；WF-4000型微波快速反應(yīng)系統(tǒng)（上海屹堯分析儀器有限公司）；FW135型手提中藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；FA1104型分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；202A-2型電熱干燥箱（上海陽(yáng)光試驗(yàn)儀器有限公司）；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取13.50 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用現(xiàn)配的60%乙醇溶解，定容于100 mL容量瓶中，搖勻，得135.0 mg/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。再精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于10.0 mL容量瓶中。依次分別加60%乙醇稀釋至5.0 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，靜置5 min，再加入0.3 mL的10%硝酸鋁溶液，迅速搖勻，靜置6 min，最后加入4 mL 4%氫氧化鈉溶液，混勻，均用乙醇稀釋至刻度，充分搖勻。放置15 min后，以不加蘆丁的試劑作空白對(duì)照，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為509 nm。得吸光度（Y）與濃度 X（mg/L）的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程Y=0.010 0X-0.000 6，R2=0.999 3。

1.2.2 白花蛇舌草總黃酮的提取

1）白花蛇舌草脫脂粉的制備。將烘干的白花蛇舌草粉碎后，過(guò)60目篩，用固液比1∶50（g∶mL，下同）的石油醚超聲提取30 min，棄去石油醚，濾渣揮干石油醚，干燥后冷卻備用，并稱重。

2）酶處理。準(zhǔn)確稱取白花蛇舌草脫脂粉1.0 g加20 mL純水，置于250 mL具塞錐形瓶中，用鹽酸溶液調(diào)pH，加入一定量纖維素酶在一定溫度下恒溫反應(yīng)一定時(shí)間后（水浴鍋中振蕩酶解160 r/min），沸水中滅活2 min，室溫下抽濾分離固體殘?jiān)蜑V液Ⅰ。

3）微波萃取。取20 mL 70%的乙醇溶液加入到濾渣中，移入微波快速反應(yīng)系統(tǒng)中，微波輔助處理2 min，趁熱過(guò)濾，得濾液Ⅱ，合并濾液Ⅰ和Ⅱ，適當(dāng)減壓濃縮，用70%乙醇定容于50 mL的容量瓶中備用。

1.2.3 總黃酮含量測(cè)定 吸取1 mL濾液于10 mL容量瓶中，按“1.2.1”的測(cè)定方法測(cè)吸光度，計(jì)算總黃酮含量和提取率。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

1）酶解時(shí)間?？疾觳煌附鈺r(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對(duì)白花蛇舌草總黃酮提取率的影響。

2）酶解溫度。考察不同酶解溫度（35、40、45、50、55、60 ℃）對(duì)白花蛇舌草總黃酮提取率的影響。

3）酶用量。分析不同比例酶用量（0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、1.8%、2.2%）對(duì)白花蛇舌草總黃酮提取率的影響。

4）pH。分析不同pH（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）對(duì)白花蛇舌草總黃酮提取率的影響。

5）微波萃取時(shí)間?？疾觳煌⒉ㄝ腿r(shí)間（2、4、6、8、10 min）對(duì)白花蛇舌草總黃酮提取率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取酶解時(shí)間（A）、酶解溫度（B）、加酶量（C）、pH（D）四個(gè)對(duì)總黃酮提取率影響較大的因素，對(duì)提取工藝條件進(jìn)行響應(yīng)面分析。因素與水平見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶解時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響 由圖1可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮提取率先增大，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到1.0 h后，總黃酮提取率不再增加，反而逐漸下降，故將最佳酶解時(shí)間定為1.0 h。

2.1.2 酶解溫度對(duì)總黃酮提取率的影響 由圖2可知，隨著酶解溫度的增加，總黃酮的提取率出現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，當(dāng)酶解溫度為50 ℃時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最大值。這是因?yàn)槊附鉁囟壬?，酶活性?huì)增強(qiáng)，但溫度過(guò)高，催化能力反而下降。因此，50 ℃是白花蛇舌草總黃酮提取的適宜溫度。

2.1.3 酶用量對(duì)總黃酮提取率的影響 由圖3可知，隨著酶用量的增大，總黃酮的提取率也隨之增大，當(dāng)酶用量達(dá)到1.0%時(shí)，單位底物上的酶濃度趨于飽和，總黃酮提取率達(dá)到最大值。隨后繼續(xù)增加酶用量，總黃酮提取率呈下降趨勢(shì)，這是因?yàn)槊赣昧窟^(guò)于飽和后，包裹住藥材顆粒，反而不利于黃酮類物質(zhì)的溢出[11]。故酶用量的最佳比例為1.0%。

2.1.4 pH對(duì)總黃酮提取率的影響 由圖4可知，隨著pH的增加，總黃酮在pH 5.0以前的提取率一直處于上升趨勢(shì)。pH超過(guò)5.0以后，總黃酮提取率又開(kāi)始下降。這可能是由于pH過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響酶的活性，因此選擇酶解體系pH以5.0為宜。

2.1.5 微波萃取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響 由圖5可知，隨著微波處理時(shí)間延長(zhǎng)，總黃酮提取率先增加后下降。當(dāng)微波萃取時(shí)間為4 min時(shí)，提取率達(dá)到最大值。隨后繼續(xù)增加微波處理時(shí)間，總黃酮提取率呈下降趨勢(shì)，主要是因?yàn)榉磻?yīng)體系受熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致黃酮類結(jié)構(gòu)破壞，致使提取率下降。因此確定微波萃取最佳時(shí)間為4 min。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

應(yīng)用 Design-Expert 8.0.5.0軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得出方差分析結(jié)果（表3）和響應(yīng)曲面結(jié)果（圖6）。

通過(guò)多元回歸擬合分析得到百花蛇舌草總黃酮提取率（Y）與酶解時(shí)間（A）、酶解溫度（B）、酶用量（C）和pH（D）之間的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=18.128+1.411 5A-0.090 3B-1.614 9C-5.2D-0.163AB+0.212 5AC+1.16AD-0.076 3BC+0.037BD+1.575CD+0.288A2+（1.43×10-3）B2-1.159 4C2+0.083D2。

由表3可以看出回歸方程的P<0.01，表明該回歸模型達(dá)到極顯著水平。失擬項(xiàng)不顯著，表明方程對(duì)試驗(yàn)擬合良好。一次項(xiàng)A、C、D，交互項(xiàng)AB、AD、BC、CD，二次項(xiàng)C2對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響極顯著（P<0.01）；交互項(xiàng)BD、二次項(xiàng)A2對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著（P<0.05）；一次項(xiàng)B、交互項(xiàng)AC、二次項(xiàng)B2、D2對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著（P>0.05）。根據(jù)Design-Expert 8.0.5.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行最優(yōu)化分析，確定最佳工藝參數(shù)為：酶解時(shí)間1.5 h，酶解溫度45.03 ℃，酶用量1.4%，pH 5.5，在此條件下預(yù)測(cè)總黃酮的提取率為4.59%。

為了驗(yàn)證模型的可靠性和穩(wěn)定性，另考慮實(shí)際操作的局限性，將最佳工藝條件調(diào)整為酶解時(shí)間1.5 h，酶解溫度45 ℃，酶用量1.4%，pH 5.5，在此試驗(yàn)條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證得總黃酮提取率平均值為4.42%（n=3）。

3 小結(jié)與討論

微波輔助萃取又稱微波萃取，是利用微波能來(lái)提高萃取速率的一種最新發(fā)展起來(lái)的技術(shù)。與傳統(tǒng)的回流萃取、索氏萃取和超聲波萃取等方法相比，具有設(shè)備簡(jiǎn)單、適用范圍廣、效率高、省時(shí)間、省試劑、污染小等特點(diǎn)[12]。纖維素酶法能有效水解細(xì)胞壁上的纖維素，加速黃酮類物質(zhì)溶出，從而提高提取率。因此采用纖維素酶解與微波萃取相結(jié)合的方法可以獲得理想的效果。

本研究用微波輔助酶法提取白花蛇舌草中總黃酮，得出最佳工藝參數(shù)為：酶解時(shí)間1.5 h，酶解溫度45 ℃，酶用量1.4%，pH 5.5，該條件下總黃酮提取率為4.42%。本方法與傳統(tǒng)方法相比，不僅可以節(jié)省時(shí)間，還可提高產(chǎn)率。該研究結(jié)果可為白花蛇舌草的深入開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 方巖雄，張永成，陳敏敏，等.抗腫瘤藥物白花蛇舌草及其活性成分[J].中成藥，2004，26（7）：577-578.

[2] 閆洪森.白花蛇舌草有效成分的超高壓提取工藝及提取物研究[D].吉林：吉林大學(xué)，2009.

[3] YOSHIDA Y，WANG M Q，LIN J N，et al. Immunomodulating activity of Chinese medicinal herbs and oldenlandia diffusa in particular[J].Iuternational Journal of Immunopharmacology，1997， 19（7）：359-370.

[4] KIM Y，PARK E J，KM J，et al. Neuroprotective constituents from Hedyotis diffusa[J].J Nat Prod，2001，64（1）：75-78.

[5] 陳永康.白花蛇舌草的化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（17）：290-293.

[6] 朱大誠(chéng)，高永濤，馬曉鵬.白花蛇舌草化學(xué)成分的研究進(jìn)展[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，23（2）：84-88.

[7] 劉軍海.白花蛇舌草中總黃酮微波輔助提取工藝研究[J].化工科技，2013，21（3）：23-26.

[8] 符穩(wěn)群，林雨婷.微波輔助萃取白花蛇舌草黃酮的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（30）：14680-14681.

[9] 謝 璟，陳永剛.超聲提取白花蛇舌草總黃酮工藝研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，31（5）：640-642.

[10] 姚田華，蔣劍平，林圣云，等.基于響應(yīng)面分析法優(yōu)化白花蛇舌草黃酮提取工藝[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，36（4）：425-429.

[11] PURI M， SHARMA D， BARROW C J. Enzyme-assisted extraction of bioactives from plants[J].Trends in Biotechnology， 2012，30（1）：37-44.

[12] 張 成，賈紹義.微波萃取技術(shù)及其應(yīng)用[J].化學(xué)工業(yè)與工程，2004，21（6）：444-447.