摘要：對(duì)黑果枸杞（Lycium ruthenicum）中原花青素的穩(wěn)定性和抗氧化性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，避光、自然光和日光燈照射條件下，原花青素穩(wěn)定性很好，不同的溫度和pH對(duì)原花青素的穩(wěn)定性影響較大。在較低的溫度和pH條件下，原花青素比較穩(wěn)定；當(dāng)溫度大于50 ℃或pH≥6，原花青素穩(wěn)定性明顯降低。原花青素具有顯著的清除·DPPH的能力，當(dāng)濃度低于0.005 mg/mL時(shí)，隨濃度增加，原花青素清除自由基的活性逐漸增加，清除率可達(dá)到77.26%。

關(guān)鍵詞：黑果枸杞（Lycium ruthenicum）；原花青素；穩(wěn)定性；抗氧化性

中圖分類號(hào)：S567.1+9；TS255.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）14-3697-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.14.039

Abstract： The stability and antioxidation of procyanidins from Lycium Ruthenicum Murray were studied， the results showed that the procyanidins was quite stable under the avoiding light， natural light or low sunlight conditions， and sensitive to temperature and pH. procyanidins was stable under a low temperature and pH， but the stability would decrease quickly when the temperature was above 50 ℃ or pH values above 6. The procyanidins have strong scavenging effects to ·DPPH radicals， and has the highest scavenging activity when the concentration of procyanidins was below 0.005 mg/mL， the clearance rate of ·DPPH was 77.26%.

Key words： Lycium ruthenicum； procyanidins； stability； antioxidation

原花青素是從植物中分離得到的可在熱酸處理下產(chǎn)生紅色花色素的多酚類化合物[1]，由兒茶素、表兒茶素聚合而成，即黃烷23，42二醇通過C4～C8鍵或C4～C6鍵相連形成二聚體、三聚體，乃至十聚體[2]。Masquelier等[3]首次發(fā)現(xiàn)了原花青素的抗氧化性能，并從海松皮中成功地提取出原花青素。原花青素是一種天然的自由基清除劑和抗氧化劑，能有效的清除·OH和O·，保護(hù)DNA免受·OH引起的氧化損傷，還可以很好的抑制脂質(zhì)過氧化[4]。因此原花青素被廣泛應(yīng)用到藥物、化妝品和功能性食品等領(lǐng)域。

黑果枸杞（Lycium ruthenicum）是茄科枸杞屬，中國西北地區(qū)所特有的多年生耐鹽、抗旱植物，其成熟漿果中富含多種天然類多酚色素物質(zhì)[5]。目前對(duì)于黑果枸杞中原花青素的報(bào)道極少，因此，從黑果枸杞中提取原花青素，并研究其穩(wěn)定性和抗氧化活性，有利于提高黑果枸杞的附加值，為新疆區(qū)域經(jīng)濟(jì)及植物資源優(yōu)勢的可持續(xù)發(fā)展提供借鑒，具有廣泛的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料

黑果枸杞采自新疆帕米爾高原，采摘后，放入烘箱中105 ℃干燥處理并粉碎，粉末放于自封袋中低溫避光保存。

兒茶素標(biāo)樣購自中國食品藥品鑒定研究所； ·DPPH自由基購自北京中生瑞泰科技有限公司；無水乙醇、濃鹽酸、香草醛、檸檬酸、磷酸氫二鈉均為分析純。

1.2 儀器

T6型新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；SHA-C型電熱恒溫水浴振蕩箱，江蘇金壇億通電子有限公司；FA2204N型電子天平，上海明橋精密科學(xué)儀器有限公司；SHZ-3型真空泵，河南省鞏義市杜甫儀器廠；RE52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；恒溫培養(yǎng)箱，常州菲普實(shí)驗(yàn)儀器廠；HWS24型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑果枸杞中原花青素的制備 取干燥后的黑果枸杞粉末，在50%乙醇，料液比（g∶mL，下同） 1∶10，50 ℃恒溫水浴振蕩箱中浸提40 min，抽濾，減壓濃縮得原花青素濃縮液，經(jīng)水適當(dāng)稀釋后，流經(jīng)大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附純化，收集洗脫液，并減壓蒸餾得紫色色漿，真空干燥得原花青素粉末。

1.3.2 原花青素含量測定 采用濃鹽酸-香草醛法[6]，取1 mL原花青素溶液，加入2.5 mL 1%的香草醛-乙醇溶液，再加入2.5 mL濃鹽酸，充分混勻后，立即在500 nm波長下測其吸光度，并做空白試驗(yàn)。每個(gè)處理平行試驗(yàn)2次，計(jì)算平均值。由于吸光度的大小與原花青素含量呈正比，故以吸光度的大小來衡量原花青素的含量。

1.3.3 pH對(duì)黑果枸杞原花青素穩(wěn)定性的影響 將pH為2.2、4.0、6.0、8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液分別加入等量的原花青素水溶液，配制成一定濃度的原花青素溶液，室溫避光保存，每隔4 h取樣，測定原花青素吸光度的變化，研究pH對(duì)原花青素穩(wěn)定性的影響。

1.3.4 溫度對(duì)黑果枸杞原花青素穩(wěn)定性的影響 用黑果枸杞原花青素粉末配制一定濃度的原花青素水溶液，分別將等量原花青素水溶液置于4、25、50、80 ℃條件下，每隔4 h取樣，測定原花青素吸光度的變化，研究溫度對(duì)原花青素穩(wěn)定性的影響。

1.3.5 光照對(duì)黑果枸杞原花青素穩(wěn)定性的影響 用黑果枸杞原花青素粉末配制一定濃度的原花青素水溶液，分別將等量原花青素水溶液置于避光、自然光和日光燈照射條件下，每隔24 h取樣，測定原花青素吸光度的變化，研究光照對(duì)原花青素穩(wěn)定性的影響。

1.3.6 黑果枸杞原花青素對(duì)·DPPH清除能力測定 ·DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，在可見光區(qū)最大吸收峰為517 nm。當(dāng)加入自由基清除劑，溶液顏色變淺，吸光度變小，且吸光度變小程度與自由基被清除程度呈線性關(guān)系，因此通過吸光度的檢測，可評(píng)價(jià)物質(zhì)清除自由基的能力。

分別配制濃度為0.001、0.002、0.004、0.005、0.010、0.020、0.050、0.100 mg/mL原花青素乙醇溶液和等濃度的·DPPH乙醇溶液，以樣品溶劑加·DPPH乙醇液作為空白管，以樣品提取液加乙醇作為對(duì)照管，取3.0 mL樣品提取液，加入3.0 mL 0.1 mmol/L的·DPPH乙醇溶液，搖勻，在室溫避光反應(yīng)30 min后，測定517 nm下的吸光度。計(jì)算原花青素對(duì)·DPPH的清除率（K）。

K=[1-（A樣品-A對(duì)照）/A空白]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 黑果枸杞中原花青素穩(wěn)定性研究

2.1.1 pH對(duì)原花青素穩(wěn)定性的影響 分別將pH為2.2、4.0、6.0、8.0的等量磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液加入到等量的黑果枸杞原花青素水溶液中，混合均勻，室溫密封避光保存，每隔4 h，在波長500 nm處測定原花青素水溶液吸光度，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。從圖1可知，當(dāng)在pH為2.2和4.0的偏酸性環(huán)境下，原花青素水溶液吸光度無明顯改變，原花青素含量基本保持不變。當(dāng)在偏中性和堿性條件下，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長，吸光度呈下降趨勢，且pH越大，吸光度的降低程度越明顯，即原花青素穩(wěn)定性隨pH的增大和儲(chǔ)存時(shí)間的延長而逐漸減低。這是因?yàn)樵ㄇ嗨亟Y(jié)構(gòu)中含有多個(gè)酚羥基，使其具有酸性，因而在堿性環(huán)境中反應(yīng)生成其他物質(zhì)，使其自身發(fā)生降解。為了更直觀的表示出pH≥6時(shí)，原花青素含量與儲(chǔ)存時(shí)間的變化關(guān)系，做出了不同pH對(duì)原花青素穩(wěn)定性影響的趨勢（圖2）。由圖2可知，吸光度與儲(chǔ)存時(shí)間呈明顯的線性關(guān)系（R2分別為0.988 0和0.986 2），通過回歸方程，可計(jì)算出在特定pH時(shí)，不同儲(chǔ)存時(shí)間原花青素的含量，這對(duì)于預(yù)測原花青素在不同儲(chǔ)存條件下含量的變化具有良好的借鑒作用。

2.1.2 溫度對(duì)原花青素穩(wěn)定性的影響 配制一定濃度等量的原花青素水溶液，分別置于4、25、50、80 ℃條件下，每隔4 h取樣，在500 nm處測定其吸光度，結(jié)果見圖3。由圖3可知，當(dāng)原花青素溶液保存于4 ℃條件下，吸光度保持恒定，當(dāng)置于25 ℃（室溫）條件下，其吸光度略有降低，但降低趨勢不明顯。由于原花青素對(duì)熱敏感，當(dāng)分別置于50 ℃和 80 ℃條件下，隨著保存時(shí)間的延長，吸光度呈明顯降低趨勢，且溫度越高，吸光度降低越快。在50 ℃和80 ℃條件下，原花青素水溶液吸光度與保存時(shí)間的趨勢見圖4。由圖4可知，其吸光度的變化與保存時(shí)間呈良好線性關(guān)系（R2分別為0.984 5和0.991 7），這對(duì)不同儲(chǔ)存時(shí)間下黑果枸杞中原花青素的含量變化具有很好的預(yù)測能力。

2.1.3 光照對(duì)原花青素穩(wěn)定性的影響 在室溫條件下，分別將等量的相同濃度的原花青素水溶液置于避光、自然光與日光燈照射（26 lx）條件下，每隔24 h取樣，測定其吸光度，結(jié)果見圖5。由圖5可以看出，隨著儲(chǔ)存時(shí)間延長，三組不同光照處理?xiàng)l件下，原花青素溶液的吸光度均未明顯降低，表明原花青素含量變化較小，因此，在特定儲(chǔ)存條件下，避光、自然光和日光燈對(duì)黑果枸杞中原花青素的穩(wěn)定性均無明顯影響。

2.2 黑果枸杞中原花青素抗氧化活性研究

研究通過原花青素對(duì)·DPPH的清除能力來檢測黑果枸杞中原花青素的抗氧化活性功能，結(jié)果見表1和圖6。由表1和圖6可知，黑果枸杞中原花青素具有很強(qiáng)的清除自由基功能，當(dāng)濃度低于0.005 mg/mL時(shí)，隨濃度增加，原花青素清除自由基的能力逐漸增強(qiáng)，清除自由基能力明顯，其抗氧化能力顯示出一定的量效關(guān)系，清除率可達(dá)到77.26%；當(dāng)濃度大于0.010 mg/mL時(shí)，隨濃度增大，原花青素清除 ·DPPH的能力增加緩慢。這與蔣其忠[6]和羅貫中[7]的研究結(jié)果趨勢一致，但黑果枸杞中原花青素清除·DPPH的能力明顯優(yōu)于茶子殼和葡萄子中原花青素清除自由基的能力。這可能與不同原料中原花青素的聚合度有關(guān)，研究認(rèn)為，原花青素2～3聚體抗脂質(zhì)過氧化能力最強(qiáng)，5～6聚體清除超氧陰離子能力最強(qiáng)[8]。

3 小結(jié)

利用不同pH、溫度和光照條件對(duì)原花青素穩(wěn)定性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，在較低溫度和pH條件下，黑果枸杞中原花青素穩(wěn)定性較好；隨著溫度的升高和pH的增大，原花青素穩(wěn)定性逐漸降低；不同的光照處理對(duì)黑果枸杞中原花青素穩(wěn)定性無明顯影響。通過黑果枸杞中原花青素對(duì)·DPPH的清除能力測定，表明黑果枸杞中原花青素具有良好的清除自由基功能，當(dāng)濃度低于0.005 mg/mL時(shí)，隨濃度增加，原花青素清除自由基的活性逐漸增強(qiáng)，清除率可達(dá)到77.26%，當(dāng)濃度大于0.010 mg/mL時(shí)，原花青素清除·DPPH的能力增加緩慢。

參考文獻(xiàn)：

[1] JAME A K，GRAHAM P J. Analysis of proanthocyanidin cleavage products of following acidcatalysis in the presence of excess phloroglucinol[J].Agric Food Chem，2001，49：1740-1746.

[2] YAHARA N，TOFANI I，MAKI K，et al. Mechanical assessment of effects of rape seed proanthocyanidins extract on tibial bone diaphysis in rats[J].J Musculoskelet Neuronal Interact，2005， 5（2）：162-169.

[3] MASQUELIER J，MICHAUD J，LAPARRA J.Flavonoides etpycnogenols[J].Int J Vitam Nutr Res，1979，49：307-311.

[4] 趙 平，任 鵬，張?jiān)缕?原花青素抗氧化活性測定方法比較[J].現(xiàn)代化工，2012，32（5）：119-122.

[5] 陳?？?，蒲凌奎，曹君邁，等.黑果枸杞的研究現(xiàn)狀及其開發(fā)利用[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，12（5）：155-157.

[6] 蔣其忠.茶籽殼原花青素的分離純化、穩(wěn)定性及抗氧化活性研究[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[7] 羅貫中.原花青素的提取、分離機(jī)抗氧化性、穩(wěn)定性的研究[D].天津：天津科技大學(xué)，2006.

[8] BOS M A，VENNAT B，MEUNIER M T，et al. Procyanidins from tormentil：Antioxidant properties towards lipoperoxidation and anti-elastase activity[J].Biol Pharm Bull，1996，19（1）：146-148.