摘要：對三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）分別飼以單純配合餌料（對照組）和“配合餌料+富硒藻粉”的混料（試驗組），研究其血清中部分免疫活性因子超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、過氧化氫酶（CAT）活性的變化，并對試驗結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果表明，試驗組三疣梭子蟹血清中的SOD活性逐漸上升，至72 h達到最高點，比對照組高44%；ACP活性24 h即呈大幅度上升趨勢，24 h時比對照組高97%，上升趨勢維持到48 h達最高點（是對照組的3.7倍），72 h仍為對照組的2.8倍；AKP活性5、24 h分別比對照組高39%、38%，48 h達最高（比對照組高80%）；CAT活性24 h是對照組的4.3倍，48 h仍為對照組的2.1倍。試驗證實，在投喂“配合餌料+富硒藻粉”的混料72 h內(nèi)，三疣梭子蟹體內(nèi)的免疫因子發(fā)生了明顯的變化，血清中SOD、ACP、AKP、CAT活性在不同時間段均有誘導性升高，顯著高于對照組水平，說明飼喂普通餌料添加一定量富硒藻粉能有效激活三疣梭子蟹的免疫活性。

關鍵詞：三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）；海洋小球藻（Chlorella saccharophila）；免疫活性

中圖分類號：S968.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）14-3687-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.14.036

Abstract： The Portunus trituberculatus was divided into control and treatment group and fed with pure bait and bait added Se algae powder to study the variety of some immune activity factor such as，SOD，ACP，AKP and CAT in serum of Portunus trituberculatus. The result showed that the SOD in the serum of the treatment group rised gradually and reached the highest at 72th hour which was higher than the control group by 44%. The ACP activity also showed a significant upward trend at 24th hour and it was higher than the control group by 97% of，the upward trend maintained to 48th hours and reached the highest point， which was 3.7 times to the control group，and it was still 2.8 times to the control group at 72th h. The AKP activity was higher than the control group by 39%，38% at 5th h and 24th h，It reached the highest at 48th hour and was higher than the control group by 80%. The CAT activity was 4.3 times to the control group at 24th h and at 48th h it was also 2 times to the control group.The results showed that the immune factors of the Portunus trituberculatus had significant changes when fed with bait added Se algae powder in 72 h，the activity of SOD，ACP，AKP，CAT in serum were elevated at different times and significantly higher than the control group. It indicated that feeding the pure bait added a certain amount of Selenium to Portunus trituberculatus could effectively activate its immune activity.

Key words： Portunus trituberculatus； Chlorella saccharophila； immune activity

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）是一種重要的海洋經(jīng)濟動物，主要分布于中國、朝鮮、日本等海域[1]。是中國沿海重要的傳統(tǒng)水產(chǎn)經(jīng)濟動物，也是中國沿海重要的養(yǎng)殖種類[2]。在養(yǎng)殖過程中主要以投喂新鮮的小雜魚蝦為主，易污染水質(zhì)。近年來由于養(yǎng)殖密度加大、投食過多，積累的殘餌、代謝廢物等有機物導致養(yǎng)殖環(huán)境的污染，損害了三疣梭子蟹免疫防御系統(tǒng)，導致其自身的抗病力下降，對病害的易感性增加，疾病頻繁發(fā)生，已成為限制三疣梭子蟹生長、存活及人工健康養(yǎng)殖的重要因素[3，4]。如近幾年由鰻弧菌、溶藻弧菌等弧菌引起的病害給三疣梭子蟹養(yǎng)殖業(yè)帶來了重大經(jīng)濟損失[5]。

研究表明，硒是一種免疫活性元素，但無機硒不能被動物體利用，它可參與藻細胞的代謝過程，轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C硒，形成硒蛋白及多糖。通過食物鏈的傳遞，進入動物及人體內(nèi)，具有抗衰老、抗氧化及增強免疫力等重要作用[6]。將其應用于畜禽及水產(chǎn)動物健康養(yǎng)殖的研究起步較晚。

由于三疣梭子蟹具有獨特的經(jīng)濟價值，因此，20世紀50年代起國內(nèi)有關三疣梭子蟹的人工養(yǎng)殖、生物學習性、生態(tài)特性、病害防治、胚胎發(fā)育及人工苗種培育等方面的研究較多，但對于三疣梭子蟹的免疫防治報道較少，仍需進一步開展研究。本試驗將富硒的海洋小球藻（Chlorella saccharophila）粉添加于三疣梭子蟹餌料中，以其血清中免疫因子超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、過氧化氫酶（CAT）為指標，研究部分免疫活性酶的活性變化，以期為三疣梭子蟹免疫防治提供理論依據(jù)，開辟水產(chǎn)動物健康養(yǎng)殖新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

三疣梭子蟹飼養(yǎng)于江蘇省連云港市萬通水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社試驗基地，平均體重（150±21.5） g，每只蟹單籠飼養(yǎng)，每5只蟹置于一個200 L PVC桶中飼養(yǎng)，持續(xù)充氣，水溫25 ℃左右，暫養(yǎng)2周后進行試驗，每天喂料換水1次。

富硒海洋小球藻藻粉來自連云港市榮盛生物科技有限公司（本文第一作者技術合作單位），該產(chǎn)品為固態(tài)條件發(fā)酵生產(chǎn)（見參考文獻[7]）。

三疣梭子蟹配合餌料：舟山市普陀新展望飼料有限公司生產(chǎn)的千島橋牌3#配合餌料（配方：魚粉35%、蝦殼粉25%、面粉20%、豆粕15%、添加劑5%，粒顆直徑為5～8 mm）。

1.2 方法

1.2.1 試驗分組 選擇健康、規(guī)格均勻的三疣梭子蟹，設試驗組和對照組。試驗組30只，每天定時早晚投喂“配合餌料+富硒藻粉（按0.2%添加）”，對照組30只按同樣方法投喂配合餌料。試驗組餌料除在預混中加了0.2%富硒藻粉之外，所用基礎料與對照組均相同。本試驗的養(yǎng)殖管理由連云港市萬通水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社試驗基地負責。

1.2.2 取樣 分別于5、24、48、72、96 h取5只三疣梭子蟹用無菌藍芯注射器從第三步足基部采血500 μL，置于1.5 mL無菌Eppendorf 離心管中（加EDTA抗凝劑300 μL），混勻， 4 ℃冰箱保存 24 h，將血漿于4 ℃ 5 000 r/min離心10 min，去沉淀，上層血清保存于-20 ℃冰箱中備用。對照組同樣操作。

1.2.3 免疫指標的測定 SOD、ACP、AKP、CAT活性的測定均采用江蘇省南京建成生物研究所生產(chǎn)的試劑盒（測定方法參見其說明書）。

1）采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性。定義：每1 mL反應液中抑制率達50.0%時所對應的SOD量為1個酶活力單位（U/mL）。

2）ACP和AKP活性的測定：采用磷酸苯二鈉法， 酶活力的計算采用金氏單位[每100 mL待測樣品在37 ℃與基質(zhì)液作用15 min產(chǎn)生1 mg酚者為1個金氏單位（Kingunit/100 mL）]。

3）CAT活性測定：CAT分解H2O2的反應可通過加入鉬酸銨而迅速終止，剩余的 H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡黃色的化合物，于波長405 nm處測定其生成量，計算其活力。

此項試驗于三疣梭子蟹150 g左右進行，間隔10 d做1次，連續(xù)做3次，數(shù)據(jù)取平均值并進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 三疣梭子蟹血清中SOD活性測定

試驗組與對照組SOD活性測定結(jié)果見圖1。由圖1可見，試驗組三疣梭子蟹血清中的SOD活性逐漸上升，至72 h達到最高點，較對照組高44%（P<0.05）；之后開始下降，96 h恢復至對照組水平；而對照組其SOD活性在24 h時略有上升，48 h下降至正常水平。

2.2 三疣梭子蟹血清中ACP活性測定

由圖2可見，試驗組三疣梭子蟹血清中ACP活性24 h即呈大幅上升趨勢，較對照組高97%（P<0.01）；上升趨勢維持到48 h達最高點，約為對照組的3.7倍（P<0.01），后逐漸下降，72 h時為對照組的2.8倍（P<0.01），96 h恢復至對照組水平。對照組 ACP 活性較穩(wěn)定，除24 h有所升高外，其他時間變化不大。

2.3 三疣梭子蟹血清中AKP 活性的測定

由圖3可見，試驗組三疣梭子蟹血清中AKP 活性自5 h即呈大幅上升趨勢，較對照組高39%（P<0.05），上升趨勢一直維持到48 h達最高點，24、48 h分別較對照組高38%（P<0.05）、80%（P<0.01），后逐漸下降，96 h恢復至對照組水平。對照組AKP活性較穩(wěn)定，在24 h稍有升高，其他時間變化不大。

2.4 三疣梭子蟹血清中CAT活性的測定

由圖4可見，試驗組三疣梭子蟹血清中CAT活性自5 h即呈上升趨勢，上升趨勢一直維持到24 h達最高點，為對照組的4.3倍（P<0.01），后逐漸下降，48 h仍然為對照組的2.1倍（P<0.01），96 h恢復至對照組水平。對照組CAT活性較穩(wěn)定，變化不大。

3 小結(jié)與討論

硒是人和動物體生命活動中必需的微量元素之一，是人及動物體內(nèi)的抗氧化劑，能提高人體免疫力，具有多種生物功能。本試驗嘗試將無機硒通過微藻富集轉(zhuǎn)化為有機硒，并添加于三疣梭子蟹的餌料中，檢測其對三疣梭子蟹血清中部分免疫活性酶活性的影響。研究結(jié)果表明，在投喂“配合餌料+富硒藻粉”的混料72 h內(nèi)，三疣梭子蟹體內(nèi)免疫活性酶的活性發(fā)生了明顯變化，其血清中SOD、ACP、AKP、CAT活性在不同時間段均有誘導性升高，明顯高于對照組水平，說明飼喂普通餌料添加一定量富硒藻粉能有效激活三疣梭子蟹的免疫活性，提高三疣梭子蟹對外來物質(zhì)識別及產(chǎn)生積極應答的水平。

節(jié)肢動物的免疫系統(tǒng)能識別范圍廣泛的外來物質(zhì)并對其產(chǎn)生積極應答，于善謙等[8]提出美國蜚蠊（Perip lanetaamericana）的同種異體亞表皮移植，排斥反應在第七天發(fā)生，并有特異性記憶。甲殼類血細胞殺死被吞噬的病原菌等異物的主要機制之一是伴隨吞噬引起的呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的具殺菌作用的氧自由基等活性氧，包括超氧陰離子自由基和過氧化氫等。丁秀云等[9]對皺紋盤鮑（Haliotisdiscushannai）血淋巴中的SOD活力進行檢測，發(fā)現(xiàn)皺紋盤鮑在注射細菌后其SOD活性降低，王淑紅等[10]利用弧菌感染雜色鮑（Haliotis diversicolor）也發(fā)現(xiàn) 其SOD活性顯著降低。本試驗中三疣梭子蟹在投喂“配合餌料+富硒藻粉”的混料后，血清中的SOD活性逐漸上升，至72 h達到最高點，較對照組高44%。在正常情況下，SOD清除活性氧自由基，當動物攝入有機硒后，開始應該會出現(xiàn)誘導性產(chǎn)生大量的自由基，SOD酶活性也在自由基的誘導下隨之升高，以清除自由基。研究表明，硒本身也可幫助清除自由基等，所以本試驗中出現(xiàn)的SOD酶活性誘導性升高屬正?，F(xiàn)象，與其他幾種酶活升高趨勢相比較平緩。ACP、AKP在體內(nèi)直接參與磷酸基團的轉(zhuǎn)移和代謝，在血細胞進行吞噬反應過程中，會伴隨有ACP的釋放[11]。本試驗發(fā)現(xiàn)試驗組三疣梭子蟹血清中ACP、AKP活性升高，說明有機硒對ACP和AKP活性有明顯刺激作用，激發(fā)了三疣梭子蟹的免疫反應。本試驗中CAT活性增強趨勢最明顯，升高幅度大，說明CAT在三疣梭子蟹免疫防御過程中發(fā)揮著重要作用。

本試驗于三疣梭子蟹養(yǎng)成期，間隔10 d連續(xù)進行了3次試驗，在試驗過程中，仔細觀察記錄三疣梭子蟹的攝食及精神狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)試驗組三疣梭子蟹活力明顯強于對照組。整個試驗未涉及其他環(huán)境因素。

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