摘要：為了建立一種快速、特異的禽源性成分檢測方法，以線粒體16S rRNA基因序列為靶位點設(shè)計雞、鴿、鵪鶉特異性引物，以常見畜禽肉（包括羊肉、牛肉、豬肉、兔肉、鴿肉、鵪鶉肉、雞肉、鴨肉、鵝肉等）DNA為模板，進行PCR擴增和特異性檢測。結(jié)果表明，篩選的引物能夠有效地對動物源性成分進行檢測，方便簡潔，可快速鑒別畜禽肉食品中含有的雞源性、鴿源性、鵪鶉源性成分。

關(guān)鍵詞：禽源性成分；16S rRNA基因；PCR；鑒別

中圖分類號：TS251.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）15-4021-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.15.056

Abstract： In order to establish a quick and specific peculiar method， which could identify the components of poultry origin. 16S rRNA gene sequence was use as target site， the specific primers of chicken， pigeon meat and quail meat were designed. The DNA of common livestock and poultry meat including mutton， beef， pork， rabbit meat， pigeon meat， quail meat， chicken， duck and goose were used as template. Though PCR amplification and specific detection， a quick determination method was established to identify the components of poultry origin. The results showed that the selected primer could identify the components of animal origin effectively and quickly. The method was convenient and concise， and could detect the chicken origin， pigeon origin and quail origin in poultry food quickly and accurately.

Key words： components of poultry origin；16S rRNA gene；PCR；identification

肉與肉制品摻雜、摻假是目前食品質(zhì)量控制面臨的重要挑戰(zhàn)。一些不法商家或個人為了追求自身利益以低價劣質(zhì)的肉冒充高價優(yōu)質(zhì)的肉，嚴重侵犯了消費者的合法權(quán)益，更直接影響著消費者的健康。因此，對食品中原料肉進行摻假、摻雜檢驗顯得尤為重要，其重點就是快速、準確地鑒定肉品成分來源[1]。

PCR技術(shù)具有特異性強、敏感性高、操作簡便、快速高效等特點，在肉類摻假檢測方面具有巨大的應(yīng)用價值，已成為肉制品品種鑒別最常用的方法之一[2]。目前，PCR技術(shù)由于其獨特的優(yōu)勢在國內(nèi)外肉類摻假的研究中已得到廣泛應(yīng)用，并取得創(chuàng)新性成果[3-5]。

在目標基因選擇方面，動物線粒體基因組DNA序列具有高度的物種特異性，是設(shè)計肉類成分定性檢測的首選靶點，包括細胞色素b（Cyt b）基因、12S rRNA、16S rRNA、D-Loop基因等[6-8]。本研究選擇16S rRNA基因序列為靶基因，通過基因序列比對，設(shè)計篩選出雞、鴿和鵪鶉的特異性引物，以羊肉、牛肉、豬肉、兔肉、鴿肉、鵪鶉肉、雞肉、鴨肉、鵝肉9種肉的DNA為模板，建立運用PCR技術(shù)鑒別雞肉、鴿肉和鵪鶉肉的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以市售合格的雞、鴨、鵝、豬、牛、羊、兔、鴿以及鵪鶉肉為材料，每種動物樣品充分攪碎混勻，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 采用離心柱式組織基因組DNA小量抽提試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取總DNA。提取的總DNA樣品溶于100 μL洗脫液TE中，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù)16S rDNA序列用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計篩選出各物種的特異性引物對，由上海生工生物工程有限公司合成。取適量引物用高壓滅菌后的超純水溶解，配制成10 μmol/L儲備液。引物序列、Tm值與擴增片段大小詳見表1。

1.2.3 PCR擴增和檢測 PCR擴增體系（25 μL）：2×Tag Master Mix（南京博爾迪公司）12.5 μL，10 μmol/L引物各0.5 μL，模板1 μL，滅菌水10.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60～62 ℃30 s，72 ℃ 60 s，28個循環(huán)；72 ℃ 4 min。反應(yīng)完成后將PCR產(chǎn)物取出，利用1.5%低溶點瓊脂糖（Promega公司）凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.4 PCR產(chǎn)物測序 PCR產(chǎn)物電泳后割膠回收純化，交由上海英駿生物技術(shù)有限公司進行測序，所有序列采用雙向測序，以便比對核實，測序結(jié)果與GenBank上已知序列進行比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同動物PCR檢測結(jié)果

分別對每種動物設(shè)計3對引物，經(jīng)過反應(yīng)條件優(yōu)化，并用同一種引物對所選擇的9種動物進行PCR擴增，最終每種動物篩選出一對特異性引物，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，具體見圖1。將PCR產(chǎn)物回收、純化、測序，將測序結(jié)果與GenBank上的已知序列進行比對，比對結(jié)果顯示，雞的測序結(jié)果與已發(fā)表序列（GenBank登錄號分別為AB086102.1、GU261713.1、GU261678.1）、鴿子的測序結(jié)果與已發(fā)表序列（GenBank登錄號分別為X87858.1、KP258178.1）、鵪鶉的測序結(jié)果與已發(fā)表序列（GenBank登錄號分別為AF302070.1、AB073301.1）的同源性均在99%以上，與預(yù)期結(jié)果基本一致，確定分別為雞肉、鴿肉和鵪鶉肉成分。

2.2 引物特異性分析

以羊肉、牛肉、豬肉、兔肉、鴿肉、鵪鶉肉、雞肉、鴨肉、鵝肉9種肉的DNA為模板，分別對所設(shè)計篩選的有關(guān)雞肉、鴿肉、鵪鶉肉的引物進行特異性分析，具體見圖2。圖2中陽性對照分別為雞肉、鴿肉和鵪鶉肉。

由圖2可見，利用雞的引物，只有雞肉的DNA模板能擴增出444 bp的目的條帶；利用鴿子的引物，只有鴿肉模板能擴增出600 bp的目的條帶；利用鵪鶉的引物，只有鵪鶉肉的DNA模板能擴增出767 bp的目的條帶。

3 討論

近年來，動物源性食品摻假、過分添加各種添加劑、使用非食用性原料和成分等食品安全事件頻發(fā)。一項對近千種肉制品的檢測分析表明，有近20%的產(chǎn)品存在標識與品種不完全相符的現(xiàn)象[2]。因此，建立快速、準確的檢測方法，研究動物源性食品安全檢測技術(shù)，對食品進行動物源性成分鑒定，有利于維護消費者利益，保障人民生命安全，也有利于肉類產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

以聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）為基礎(chǔ)的技術(shù)已逐步成為肉類種屬鑒定的核心方法。研究者根據(jù)不同物種基因序列的差異位點設(shè)計特異性引物，利用PCR反應(yīng)實現(xiàn)食品中特征基因片段的指數(shù)級擴增，繼而通過電泳檢測鑒別食品中可能的物種來源。Girish等[6]基于線粒體12S rRNA基因，應(yīng)用PCR-RFLP成功鑒定了牛肉、水牛肉、綿羊肉及山羊肉。Ghovvati等[4]基于線粒體12S rRNA和16S rRNA基因應(yīng)用多重PCR技術(shù)對反芻動物、家禽和豬進行鑒別。Soares等[9]應(yīng)用雙重PCR在豬肉中成功檢測到禽肉。陳文炳等[10]應(yīng)用單重PCR和雙重PCR分別對食品中豬肉、牛肉、羊肉、雞肉等肉類成分進行鑒定。陳冬等[11]利用牦牛、普通牛、水牛作為研究材料，在牛線粒體12S rRNA基因通用引物擴增片段區(qū)域發(fā)現(xiàn)3個特異的酶切位點，可用于混合鮮牛肉及制品的牛種來源的鑒別。何瑋玲等[12]基于動物線粒體細胞色素b基因的差異性位點，設(shè)計兩組各5條長度不同的多重PCR引物，建立并優(yōu)化多重PCR反應(yīng)體系，通過電泳檢測擴增產(chǎn)物分子量差異，實現(xiàn)4種肉類（豬肉、牛肉、羊肉和雞肉）的快速鑒別。王穎等[13]以豬線粒體12S rRNA基因序列為靶位點設(shè)計引物和探針，進行熒光定量PCR擴增，建立了豬源性成分檢測方法。

本研究主要根據(jù)雞、鴿、鵪鶉線粒體基因組編碼基因16S rRNA序列的位點差異設(shè)計各物種特異性引物，進行PCR擴增檢測，經(jīng)過多次反復(fù)試驗，建立了快速、準確的雞肉、鴿肉、鵪鶉肉PCR鑒定方法，該方法樣品用量少，反應(yīng)體系簡單，對設(shè)備要求不高，成本低廉，在下一步工作中，將開展16S rRNA序列熒光定量PCR技術(shù)，進一步研發(fā)食品中不同動物源性成分分析方法，為肉制品質(zhì)量安全控制探索新的途徑，為保護消費者權(quán)益提供技術(shù)支撐，并為保護肉類產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供技術(shù)監(jiān)督。

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