摘要：為優(yōu)化微波輔助酶法提取白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd.）多糖工藝。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，應(yīng)用中心組合設(shè)計(jì)，采用二次多項(xiàng)式逐步回歸分析對(duì)提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，確定微波輔助酶法提取白花蛇舌草多糖工藝最佳條件為酶解時(shí)間2.9 h，酶解溫度60 ℃，酶用量0.9%，pH 6.0；按此工藝條件，提取3次，白花蛇舌草多糖平均含量可達(dá)31.02%。

關(guān)鍵詞：白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd.）；多糖；微波輔助；酶法

中圖分類號(hào)：R282 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）15-3975-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.15.044

Abstract： Microwave-assisted enzymetic extraction of polysaccharide in Hedyotis diffusa Willd. was studied by using single factor experiment and central composite design combining quadratic polynomial stepwise regression analysis. It was concluded that the optimal conditions of extraction were enzymolysis time 2.9 h，enzymolysis temperature 60 ℃，enzyme dosage 0.9% and pH 6.0. Under these conditions， the three-time extraction yield of polysaccharide in Hedyotis diffusa Willd. was up to 31.02%.

Key words： Hedyotis diffusa Willd.； polysaccharide； microwave-assisted； enzymetic method

白花蛇舌草為茜草科植物白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd.） 的干燥全草，廣泛分布于中國(guó)東南和西南各省，具有清熱解毒、消痛散結(jié)、利濕除濕的功效，專治各種類型炎癥，是民間常用中草藥[1]。白花蛇舌草中含量大量生物活性物質(zhì)，如總黃酮、總多糖、齊墩果酸、豆甾醇、三萜類等成分，其中多糖類物質(zhì)具有抑制腫瘤、抗菌消炎和免疫調(diào)節(jié)的作用[2]。臨床上廣泛應(yīng)用于各種癌癥的治療，如肝癌、食道癌、結(jié)腸癌、鼻咽癌等，并取得了較好的療效[3]。目前，關(guān)于白花蛇舌草多糖的提取方法主要有熱水回流法[4-6]、醇提法[7]及脫脂水提醇沉法[8]，且優(yōu)化白花蛇舌草多糖的提取工藝多采用正交試驗(yàn)法，而用微波輔助聯(lián)合酶法提取白花蛇舌草多糖的方法鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，使用響應(yīng)面分析法優(yōu)化白花蛇舌草多糖的提取工藝，為白花蛇舌草多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

白花蛇舌草藥材購(gòu)自贛州市丁氏草藥店，經(jīng)贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥鑒定教研室程齊來(lái)教授鑒定。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（含量≥98%，北京索萊寶科技有限公司）；纖維素酶（3×104 U/g，江蘇淮安百麥綠色生物能源有限公司）；無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、鹽酸、苯酚、濃硫酸均為分析純。

UV-6100PCS型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；SHA-C型水浴恒溫振蕩器（金壇市白塔新寶儀器廠）；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市城東新瑞儀器廠）；WF-4000型微波快速反應(yīng)系統(tǒng)（上海屹堯分析儀器有限公司）；FW135型手提中藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；FA1104型分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；202A-2型電熱干燥箱（上海陽(yáng)光試驗(yàn)儀器有限公司）；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TDL-50B型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取50 mg D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水溶解，定容于50 mL容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別用蒸餾水定容至10 mL，搖勻，再分別取0.2 mL溶液于8個(gè)干燥比色管中，向各管分別加入0.5 mL 5%苯酚、2.5 mL濃硫酸，搖勻，室溫下放置20 min，以不加標(biāo)準(zhǔn)溶液為空白，在波長(zhǎng)490 nm處分別測(cè)定其吸光度，繪制葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得回歸方程為Y=0.082 8X+0.031 0，R2=0.999 7，式中Y為提取液的吸光度，X為提取液中多糖的質(zhì)量濃度。

1.2.2 白花蛇舌草多糖的提取

1）白花蛇舌草脫脂粉的制備：將烘干的白花蛇舌草粉碎后，過(guò)60目篩，用一定比例的乙酸乙酯超聲提取30 min，棄去乙酸乙酯，濾渣揮干乙酸乙酯，干燥后冷卻備用，并稱重。

2）酶處理：準(zhǔn)確稱取白花蛇舌草脫脂粉1.0 g加25 mL去離子水，置于250 mL具塞錐形瓶中，用鹽酸溶液調(diào)pH，加入一定量纖維素酶在一定溫度下恒溫反應(yīng)一定時(shí)間后，滅酶20 min。

3）微波萃取：將酶解好的混合液冷卻至室溫后移入微波快速反應(yīng)系統(tǒng)中，微波反應(yīng)一定時(shí)間后，趁熱過(guò)濾，將濾液80～90 ℃真空減壓濃縮，得濃縮液。

4）醇沉：將濃縮液按體積比1∶3加入95%乙醇，搖勻后進(jìn)行醇沉，靜置過(guò)夜。

5）干燥：將醇沉液4 000 r/min離心10 min，沉淀物置于60 ℃恒溫干燥箱中干燥，干燥后的產(chǎn)物即為白花蛇舌草粗多糖。

1.2.3 多糖含量測(cè)定 取白花蛇舌草多糖提取物適量，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加蒸餾水使其溶解，稀釋至刻度，搖勻，精密量取4 mL置于10 mL量瓶中加蒸餾水至刻度，搖勻，得到白花蛇舌草多糖供試品溶液；精密量取0.2 mL置具塞試管中，按“1.2.1”操作。測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖提取粗品中多糖的含量。

多糖含量=樣品溶液中葡萄糖含量×樣品溶液稀釋倍數(shù)×反應(yīng)液體積/粗提物重量×100%

1.2.4 單因素試驗(yàn) ①酶解時(shí)間。考察不同酶解時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對(duì)白花蛇舌草多糖含量的影響；②酶解溫度。考察不同酶解溫度（40、45、50、55、60 ℃）對(duì)白花蛇舌草多糖含量的影響；③酶用量。分析不同比例酶用量（0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%）對(duì)白花蛇舌草多糖含量的影響；④pH。分析不同pH（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）對(duì)白花蛇舌草多糖含量的影響；⑤微波萃取時(shí)間?？疾觳煌⒉ㄝ腿r(shí)間（2、4、6、8、10、12 min）對(duì)白花蛇舌草多糖含量的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，微波萃取時(shí)間對(duì)多糖含量影響不大，固定微波萃取時(shí)間為4 min，酶解時(shí)間（A）、酶解溫度（B）、加酶量（C）及pH（D）對(duì)多糖含量影響較大，以這4個(gè)因素為自變量，對(duì)提取工藝條件進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

1.2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 對(duì)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)優(yōu)化后的白花蛇舌草多糖提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶解時(shí)間對(duì)白花蛇舌草多糖含量的影響 由圖1可知，隨著酶解時(shí)間的增加，白花蛇舌草多糖含量不斷增加，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到2.5 h后，多糖含量不再增加，反而下降。這是因?yàn)槊附鈺r(shí)間太短，酶解不充分；酶解時(shí)間太長(zhǎng)，又會(huì)造成多糖分解或結(jié)構(gòu)變化。因此，最佳酶解時(shí)間為2.5 h。

2.1.2 酶解溫度對(duì)白花蛇舌草多糖含量的影響 由圖2可知，隨著酶解溫度的增加，白花蛇舌草多糖含量先逐漸增加，在酶解溫度為55 ℃時(shí)，多糖含量達(dá)到最大值。這是因?yàn)殡S著酶解溫度的升高，酶解活性會(huì)增強(qiáng)，但超過(guò)最適溫度后，酶催化能力反而下降，故酶解溫度超過(guò)55 ℃后，多糖含量呈下降趨勢(shì)。因此，選擇白花蛇舌草多糖提取的適宜酶解溫度為55 ℃。

2.1.3 酶用量對(duì)白花蛇舌草多糖含量的影響 由圖3可知，當(dāng)酶用量從0.3%增至0.6%時(shí)，白花蛇舌草多糖含量增幅最大；酶用量從0.6%增至0.9%時(shí)，多糖含量基本不變。隨后增加酶用量，多糖的含量逐漸下降。這是因?yàn)槊赣昧匡柡秃?，?duì)多糖組分有包埋效應(yīng)，反而限制多糖組分從細(xì)胞組織中析出。因此，確定酶用量為0.6%。

2.1.4 pH對(duì)白花蛇舌草多糖含量的影響 由圖4可知，隨著pH的增加，白花蛇舌草多糖含量在pH 5.5以前一直處于上升趨勢(shì)。pH超過(guò)5.5后，多糖含量開(kāi)始下降。這可能是由于pH過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響酶的活性，進(jìn)而影響多糖得率，因此，選擇酶解體系pH以5.5為宜。

2.1.5 微波萃取時(shí)間對(duì)白花蛇舌草多糖含量的影響 由圖5可知，隨著微波處理時(shí)間延長(zhǎng)，白花蛇舌草多糖含量先增加后下降。當(dāng)微波萃取時(shí)間為 4 min時(shí)，多糖含量達(dá)到最大值。隨后繼續(xù)增加微波處理時(shí)間，多糖含量呈下降趨勢(shì)。因?yàn)槲⒉ㄝ腿r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致多糖分解，致使含量下降。因此，初步確定微波萃取最佳時(shí)間為4 min。

2.2 白花蛇舌草多糖提取工藝回歸模型的建立及方差分析

應(yīng)用 Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到方差分析結(jié)果（表3）和響應(yīng)曲面（圖6、圖7、圖8）。通過(guò)多元回歸擬合分析得到百花蛇舌草多糖含量（Y）與酶解時(shí)間（A）、酶解溫度（B）、酶用量（C）和pH（D）之間的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=301.42-0.80×A+1.83×B-8.93×C-121.58×D-0.04×A×B+15.98×A×C+3.64×A×D+0.13×B×C+1.54×B×D-3.93×C×D-5.82×A2-0.09×B2-10.83×C2+2.95×D2。

由表3可以看出，回歸方程的P<0.01，表明該回歸模型達(dá)到極顯著水平。模型的確定系數(shù)達(dá)0.958 8，說(shuō)明該模型能解釋95.88%響應(yīng)值的變化。失擬項(xiàng)不顯著（P=0.887 2>0.05），表明方程對(duì)試驗(yàn)擬合良好，試驗(yàn)誤差小。各因素對(duì)多糖含量的影響極顯著（P<0.01），影響程度大小依次為酶解溫度>pH>酶解時(shí)間>酶用量。考察因素間的交互作用，由方差分析可知，在數(shù)學(xué)回歸模型中，AC和BD二項(xiàng)存在極顯著的交互作用，即酶解時(shí)間與酶用量、酶解溫度和pH的交互作用對(duì)多糖含量有極顯著影響（P<0.01）；酶解時(shí)間和pH的交互作用對(duì)多糖含量影響顯著（P<0.05）。根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行最優(yōu)化分析，確定最佳工藝參數(shù)為酶解時(shí)間2.9 h，酶解溫度60 ℃，酶用量0.9%，pH 6.0，在此條件下預(yù)測(cè)多糖含量為31.97%。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了檢驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件，即酶解時(shí)間2.9 h，酶解溫度60 ℃，酶用量0.9%，pH 6.0，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到白花蛇舌草多糖含量平均值為31.02%，理論含量31.79%，與理論值相差不大。

3 小結(jié)與討論

微波輔助萃取又稱微波萃取，是利用微波能來(lái)提高萃取速率的一種最新技術(shù)。與傳統(tǒng)的回流萃取、索氏萃取和超聲波萃取等方法相比，具有設(shè)備簡(jiǎn)單、適用范圍廣、效率高、省時(shí)間、省試劑、污染小等特點(diǎn)[9]。纖維素酶能水解細(xì)胞壁上的纖維素，使細(xì)胞內(nèi)多糖類物質(zhì)充分溶出，從而提高多糖得率。因此，采用纖維素酶解與微波萃取相結(jié)合的方法可以獲得理想的效果。

本試驗(yàn)用微波輔助酶法提取白花蛇舌草中多糖，得出最佳工藝參數(shù)為酶解時(shí)間2.9 h，酶解溫度60 ℃，酶用量0.9%，pH 6.0，該試驗(yàn)條件下多糖含量為31.02%（n=3）。本試驗(yàn)得到的白花蛇舌草中多糖含量較高，有一定的研究意義，可為白花蛇舌草的提取、純化及深入開(kāi)發(fā)利用等提供一定的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 方巖雄，張永成，陳敏敏，等.抗腫瘤藥物白花蛇舌草及其活性成分[J].中成藥，2004，26（7）：577-578.

[2] 代 龍，楊培民，魏永利.中藥白花蛇舌草研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2009，23（4）：75-78.

[3] 廖嬋嬋，劉 鴻.白花蛇舌草的化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥，2012，7（11）：1487-1488.

[4] 李春玲，高艷艷，賈愛(ài)卿，等.白花蛇舌草多糖的提取工藝研究[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2008，27（6）：26-27.

[5] 楊培民，代 龍，魏永利，等.白花蛇舌草多糖的提取純化工藝研究[J].齊魯藥事，2009，28（9）：549-551.

[6] 蔣劍平，許海順，熊耀康，等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化白花蛇舌草水溶性多糖的提取工藝[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，36（2）：187-191.

[7] 趙浩如，李 瑞，陳乃林，等.白花蛇舌草不同提取工藝對(duì)抗腫瘤活性的影響[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，33（6）∶510-513.

[8] 凌育趙.白花蛇舌草多糖的分離提取及含量測(cè)定[J].生物技術(shù)，2005，15（4）：48-50.

[9] 張 成，賈紹義.微波萃取技術(shù)及其應(yīng)用[J].化學(xué)工業(yè)與工程，2004，21（6）：444-447.