摘要：本研究將啟動(dòng)子P43與透明顫菌血紅蛋白（Vitreoscilla hemoglobin）基因（vgb）通過重疊PCR進(jìn)行融合，克隆到芽孢桿菌表達(dá)載體pCM20上，將篩選得到的重組載體pCM20-vgb轉(zhuǎn)化多粘芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）NR1，Western-Blot表明重組菌株表達(dá)了VHb蛋白，該蛋白的表達(dá)對重組菌體的生長和多粘菌素的產(chǎn)生均有促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：多粘芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）；透明顫菌血紅蛋白（Vitreoscilla hemoglobin）基因；多粘菌素

中圖分類號：Q813.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）15-3907-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.15.026

Abstract： The Vitreoscilla hemoglobin（VHb） gene（vgb） was placed under the control of the P43 promoter by overlapping extension PCR. The vgb expression cassette was cloned into the vector pCM20 which was transformed into strain Paenibacillus polymyxa NR1. The production of VHb confirmed by Western-Blot promoted the growth of the strain and improved the yield of polymyxin.

Key words： Paenibacillus polymyxa； Vitreoscilla hemoglobin （VHb） gene； polymyxin

在氧濃度比較低的環(huán)境中，透明顫菌血紅蛋白基因的表達(dá)可以促進(jìn)微生物細(xì)胞胞內(nèi)氧的傳輸和提高氧的利用效率。多個(gè)研究表明透明顫菌血紅蛋白（VHb）對許多宿主細(xì)胞的生長及代謝產(chǎn)物的生成都有明顯的促進(jìn)作用。透明顫菌血紅蛋白基因（vgb）已被成功克隆到多種細(xì)菌、放線菌、酵母和植物中[1-5]。該基因也被引入到很多芽孢桿菌中，如Feng等[6]將vgb基因轉(zhuǎn)入蘇云金芽孢桿菌后，低氧發(fā)酵條件下菌體數(shù)量和伴孢晶體產(chǎn)量分別提高了1.59倍和3.13倍。Kallio等[7]將vgb基因轉(zhuǎn)入產(chǎn)淀粉酶枯草芽孢桿菌后，其菌體數(shù)量和淀粉酶活力分別提高了30%和17%。

多粘芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，如多粘菌素（Polymyxin）、粘菌素（Colistin）、環(huán)桿菌素（Circulin）、殺鐮孢菌素（Fusaricidins）等，這些物質(zhì)的產(chǎn)生和產(chǎn)量與發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵溫度、pH、溶氧、補(bǔ)料與否等條件密切相關(guān)[8]。在這些因素中，溶氧是非常重要的一個(gè)因素，且對于多粘芽孢桿菌自身菌體的生長和芽孢形成有重要影響。

多粘芽孢桿菌是一種極度好氧細(xì)菌，在發(fā)酵中后期會由于菌體密度過大而造成供氧不足，從而影響菌體的生長以及代謝產(chǎn)物的合成。本研究以實(shí)驗(yàn)室分離得到的多粘芽孢桿菌 NR1為研究對象，嘗試在該菌中克隆表達(dá)VHb，以提高多粘芽孢桿菌中多粘菌素的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 多粘芽孢桿菌NR1為實(shí)驗(yàn)室自行篩選，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）168為實(shí)驗(yàn)室保存，Escherich coli Top10購自上海生物工程股份有限公司，質(zhì)粒pMD18T、pCM20、pMD18T-vgb為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 工具酶及試劑 限制性內(nèi)切酶、連接酶及Taq酶均購自TaKaRa公司?？股丶捌渌噭┚徸陨虾Ｉ锕こ坦煞萦邢薰尽?/p>

1.1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基1 L，pH 7.0）：10 g NaCl、10 g蛋白胨、0.5 g 酵母浸粉。發(fā)酵培養(yǎng)基（1 L，pH 7.0）：30 g淀粉、15 g葡萄糖、8 g （NH4）2SO4、1 g NaCl、1 g KH2PO4、0.2 g MgSO4、3 g CaCO3、3%玉米漿30 mL。

1.2 方法

1.2.1 引物和測序 引物合成和測序均由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2.2 提取、酶切、連接和轉(zhuǎn)化 芽孢桿菌總DNA的提取、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備，質(zhì)粒的提取、酶切、連接和轉(zhuǎn)化均參照文獻(xiàn)[9-11]。

1.2.3 P43啟動(dòng)子與vgb基因的克隆和融合 以枯草芽孢桿菌168的總DNA為模板，用引物BP43F/R擴(kuò)增枯草芽孢桿菌P43啟動(dòng)子，上游引物BP43F引入EcoR V酶切位點(diǎn)；以質(zhì)粒pMD18T-vgb為模板，用引物vgbF/R擴(kuò)增得到vgb基因，下游引物vgbR也引入EcoR V酶切位點(diǎn)。再以上述兩個(gè)片段為模板，用引物BP43F和vgbR將P43啟動(dòng)子片段和vgb基因片段進(jìn)行重疊PCR得到融合片段。

1.2.4 多粘芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化 將上述方法得到的融合片段插入pCM20的EcoR V位點(diǎn)中，經(jīng)過篩選得到重組子。將重組載體pCM-vgb電轉(zhuǎn)化多粘芽孢桿菌，在紅霉素平板上挑取多個(gè)菌落，通過PCR鑒定，挑選多個(gè)陽性菌落進(jìn)行下一步的發(fā)酵研究。

1.2.5 生長曲線的測定 為檢測帶有vgb基因重組載體的導(dǎo)入對宿主多粘芽孢桿菌生長情況的影響，將單獨(dú)導(dǎo)入pCM20的對照菌株和轉(zhuǎn)化了pCM20-vgb的重組菌株用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，然后以1%的量轉(zhuǎn)接至LB新鮮培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣測定菌體OD600，繪制生長曲線。

1.2.6 發(fā)酵效價(jià)的測定 按照《中國藥典》2010版（CP2010）抗生素微生物檢定法（附錄XIA），質(zhì)量檢測按照《中國藥典》2010版的規(guī)定。發(fā)酵液經(jīng)12 000 r/min離心10 min，取上清液，以雙碟擴(kuò)散法測定發(fā)酵效價(jià)，指示菌為大腸埃希氏菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 vgb基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

用試劑盒提取枯草芽孢桿菌168的基因組DNA，使用引物BP43F/R擴(kuò)增枯草芽孢桿菌P43啟動(dòng)子，得到長為0.42 kb的片段，同時(shí)以質(zhì)粒pMD18T-vgb為模板，用引物vgbF/R擴(kuò)增得到長為0.44 kb的vgb基因片段，以上述兩個(gè)片段為模板，使用重疊PCR技術(shù)得到一個(gè)同時(shí)含有兩個(gè)基因的融合片段，采用酶切酶連的方式構(gòu)建至pCM20載體上pCM20-vgb，經(jīng)篩選鑒定后得到重組質(zhì)粒pCM20-vgb（圖1）。

2.2 血紅蛋白表達(dá)分析

透明顫菌血紅蛋白分子量大小為16 kD。SDS-PAGE分析結(jié)果表明，重組菌株發(fā)酵48 h后的菌體蛋白比原始菌株在16 kD處新增加了一條蛋白帶，與預(yù)期相符合。進(jìn)而用Western Blot進(jìn)一步驗(yàn)證該重組菌株中透明顫菌血紅蛋白基因的表達(dá)，結(jié)果（圖2）證實(shí)了SDS-PAGE的結(jié)論。

2.3 VHb的表達(dá)對重組菌株生長發(fā)酵的影響

分別在正常供氧和貧氧兩種條件下測定了重組菌株和原始菌株的生長曲線（圖3），在正常供氧情況下顯示在發(fā)酵的前半階段（24 h以前），兩者的生長速率、生物量積累速率基本一致。原始菌株從30 h后就快速進(jìn)入穩(wěn)定期，36 h左右菌體密度達(dá)到最大值，40 h后菌體開始大量降解，48 h左右全部形成了芽孢。作為對比，重組菌株大概在40 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期，44 h左右菌體密度達(dá)到最大值，48 h后菌體開始大量降解，54 h左右全部形成芽孢。通過計(jì)數(shù)，雖然重組菌株的發(fā)酵周期要長一些，但是其芽孢形成數(shù)與原始菌株相當(dāng)，都在6億/mL左右，表明了該基因的表達(dá)對于芽孢形成的改善作用不大。與此對應(yīng)的是在貧氧條件下，原始菌株較快進(jìn)入穩(wěn)定期，18 h左右即進(jìn)入穩(wěn)定期，24 h菌體密度達(dá)到最大，35 h時(shí)開始大量降解；重組菌株在此條件下表現(xiàn)稍好一些，在22 h進(jìn)入穩(wěn)定期，28 h密度達(dá)到最大，38 h時(shí)開始大量降解。由此可見，該菌可以在缺氧條件下有效延遲和延長其穩(wěn)定生長期，這對于今后將該菌株用于發(fā)酵具有重要的意義。

2.4 VHb的表達(dá)對于重組菌株多粘菌素產(chǎn)量的影響

將重組菌株和原始菌株分別在正常供氧和貧氧條件下?lián)u瓶培養(yǎng)一段時(shí)間后，測定多粘菌素的產(chǎn)量。結(jié)果（圖4）顯示，無論是在正常供氧還是貧氧條件下，多粘菌素的產(chǎn)量都得到了提高。在正常供氧條件下，重組菌株產(chǎn)量比原始菌株提高了24.9%；在貧氧條件下重組菌株產(chǎn)量比原始菌株提高了31.0%。

3 小結(jié)與討論

VHb蛋白已被證明了能在多種宿主中進(jìn)行表達(dá)且能顯著提高相關(guān)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。本研究成功構(gòu)建了含有vgb基因的表達(dá)載體，并將其電擊轉(zhuǎn)化多粘芽孢桿菌NR1中實(shí)現(xiàn)了VHb的表達(dá)。VHb的表達(dá)明顯提高了多粘芽孢桿菌在低溶氧發(fā)酵條件下的生物量，同時(shí)也提高了多粘菌素的產(chǎn)量。因此，vgb基因的表達(dá)成為解決供氧限制的一種新方法。該基因的應(yīng)用可以降低氧氣及能量的消耗，亦不需增加額外的設(shè)備投資，卻可大大降低發(fā)酵的成本。綜上所述，vgb基因的發(fā)現(xiàn)和研究為利用分子生物學(xué)技術(shù)解決微生物發(fā)酵問題提供了良好途徑。

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