摘要：以湖北百合（Lilium henryi Baker）鱗片為材料，將鱗片接種于4種不同配方的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，篩選出最佳配方，用此配方誘導(dǎo)出叢生芽，以叢生芽為誘變材料，在無菌條件下，將浸透秋水仙素溶液濃度分別為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%的脫脂棉覆蓋在新芽上，分別處理24、36、48 h。結(jié)果表明，芽誘導(dǎo)的最佳配方為6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，0.10%的秋水仙素處理48 h的誘變效果最佳，誘變率達(dá)20%。植株外觀形態(tài)及氣孔鑒定結(jié)果顯示，多倍體植株葉片厚且增大，葉色加深，氣孔的長、寬明顯變大，保衛(wèi)細(xì)胞密度減小。根尖染色體鑒定顯示，四倍體植株的染色體數(shù)為48條（2n=4x=48），而二倍體的植株染色體數(shù)為24條。

關(guān)鍵詞：湖北百合（Lilium henryi Baker）；誘變；秋水仙素；多倍體

中圖分類號：S682.2+65.6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）12-3117-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.12.029

Abstract： The scales of Lilium henryi Baker were inoculated in four bud induction medium with different formula to screen the best medium which was used to induce multiple shoots so as to provide material for mutagenesis. The buds were covered by absorbent cotton saturated with colchicine solution at different concentration（0.05 %，0.10 %，0.15 %，0.20 %） for 24，36，48 h under sterile conditions. The results showed that the best bud induction formula was 6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L；while the most effective mutagenic conditions were treating with 0.10 % colchicine solution for 48 h，of which the mutation rate was 20 %. According to the identification result of plant morphology and stomata， leaf thickness of polyploidy plants increased； and the color was darken； length and width of stomata was significantly larger； density of guard cells decreased. According to chromosome observation of root tip， the chromosome number of tetraploid plants were 48（2n=4x=48）；of diploid plants were 24.

Key words： Lilium henryi Baker； mutagenesis； colchiceine； polyploid

湖北百合（Lilium henryi Baker）屬于百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium L.）卷瓣組（Sect. Lilium）的一種多年生草本植物[1]，在貴州、重慶、湖北、江西等?。ㄊ校┚蟹植糩2]。其花色艷麗，花姿典雅，氣味芳香獨特，具有較高的觀賞、食用、藥用等價值[3，4]。湖北百合是中國特有的野生植物[2]，由于人工大量的采挖，使湖北百合數(shù)量急劇下降，質(zhì)量也有所降低[5]，屬于瀕危植物[2]，急需保護(hù)現(xiàn)有野生資源。植物組織離體培養(yǎng)是一種較快的保護(hù)途徑[6]，并且湖北百合離體培養(yǎng)在鱗莖、幼葉、花蕾等[2，3，7，8]外植體均有報道。多倍體植株具有諸多的優(yōu)良特性，表現(xiàn)為品質(zhì)和產(chǎn)量較優(yōu)[9，10]，還具有植株健壯、器官膨大、葉片變大、色深、氣孔變大及抗性提高等特征特性的變化[9-11]。所以多倍體研究越來越受到重視，已在大蒜[12]、榨菜[13]、滇楊[14]、杭白菊[15]、蘿卜[16]、大白菜[17]等物種上獲得成功。國內(nèi)在百合多倍體方面的研究也取得了較大進(jìn)展，自黃濟(jì)明[18]首次采用試管培養(yǎng)誘導(dǎo)百合多倍體成功以來，已在龍牙百合[19]、東方百合[20]、蘭州百合[21]等種類都成功誘導(dǎo)出多倍體，而湖北百合誘變多倍體方面的研究未見報道。為此，試驗利用秋水仙素處理湖北百合，通過系統(tǒng)的配方篩選，探討最佳的誘變配比組合，以期為湖北百合的離體保護(hù)并為擴(kuò)大栽培面積、提高產(chǎn)量和品質(zhì)、為新種質(zhì)的創(chuàng)制和豐富百合品種提供新途徑與新方法，從而為后續(xù)百合育種研究提供新材料。

1 材料與方法

1.1 材料

2013年12月，在凱里市周邊收集湖北百合鱗莖，種植于凱里學(xué)院實驗基地內(nèi)，常規(guī)管理。試驗前選擇無病蟲害及大小一致的鱗莖作為組織培養(yǎng)及誘導(dǎo)多倍體的外植體材料；試劑主要有乙醇、醋酸、升汞、卡寶-品紅染色液等，藥品主要有秋水仙素、6-BA、NAA、蔗糖、瓊脂等，MS培養(yǎng)基自配；儀器主要有超凈工作臺、體視顯微鏡等。

1.2 方法

1.2.1 叢生芽誘導(dǎo) 對湖北百合鱗莖取中間部位的鱗片作為外植體材料，將取下的鱗片先用洗衣粉溶液浸泡10～15 min，然后用自來水沖洗2 h去除外部污漬，在無菌超凈工作臺上用70%乙醇消毒30～35 s，無菌水清洗3～4次，再用0.1%升汞消毒10～15 min，最后用去離子水沖洗5～6次，將消毒好的鱗片放在無菌濾紙上，備用。在無菌培養(yǎng)皿上，先切取鱗片中下部大約0.5 cm×0.5 cm大小的方塊[3]，再將鱗片分別接種于以MS作為基本培養(yǎng)基的4種不同配方的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，4種芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別是：①6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L[2，9，22-24]；② 6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L[25]；③ 6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L +蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L[26]；④6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L[27-29]。4種芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH均為5.8～6.0，每瓶接3個鱗片，每個配方分別接40瓶。將所有培養(yǎng)瓶置于室溫（20～25 ℃）里培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照度800～1 200 lx、光照時間為12 h/d[30]，至芽長到0.5～1.0 cm（30-40 d）時，觀察并記錄叢生芽生長情況，統(tǒng)計污染數(shù)、褐化數(shù)、存活數(shù)等，計算叢生芽誘導(dǎo)率。

叢生芽誘導(dǎo)率=（長叢生芽的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100%。

1.2.2 多倍體誘導(dǎo) 取長度0.5～1.0 cm的叢生芽作為多倍體誘導(dǎo)材料，將秋水仙素（過濾滅菌）及脫脂棉滅菌，分別用0.05%、0.10%、0.15%、0.20%的秋水仙素溶液浸透脫脂棉，覆蓋在叢生芽上，分別處理24、36、48 h[31]，每個處理10瓶，每瓶2個叢生芽。再將叢生芽轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基（MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 mg/L）[32]中培養(yǎng)，經(jīng)過30～50 d（培養(yǎng)條件同上），觀察并記錄其變化情況（同上）。

誘導(dǎo)芽存活率=（誘導(dǎo)芽存活數(shù)/接種芽總數(shù)）×100%。

將處理后的生長植株轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基1/2 MS+NAA 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 mg/L進(jìn)行生根培養(yǎng)[2]。待根長至2 cm左右，取健壯植株馴化移栽。

1.2.3 多倍體的篩選與鑒定 ① 植株外觀形態(tài)鑒定。對處理植株與對照植株進(jìn)行外形觀察，初步篩選變異植株。②氣孔鑒定。在晴天上午9：00～10：00[33]，分別選擇處理和對照植株進(jìn)行葉片觀察，每個株系分別取2片新鮮葉。先用去離子水洗凈下表皮，再用鑷子撕取葉片中部的下表皮，置于載玻片上，加一滴去離子水，蓋上蓋玻片制成臨時玻片[34]。顯微鏡下觀察時，先在10×10倍鏡下每片葉隨機(jī)觀察5個視野，一個株系觀察10個視野，記錄并測量各視野中保衛(wèi)細(xì)胞的數(shù)目及各視野面積；再在10×20倍鏡下隨機(jī)觀察40個氣孔，用經(jīng)校正的目鏡測微尺測量保衛(wèi)細(xì)胞的長、寬及氣孔的長、寬。根據(jù)如下公式[34]計算氣孔密度：

氣孔密度=各視野的氣孔總數(shù)（個）/各視野面積（mm2）。

③染色體鑒定。于晴天上午9：00～11：00，選取經(jīng)過氣孔鑒定后的植株根，用剪刀剪取長約0.5～1.0 cm的嫩白健壯根尖，隨即用去離子水清洗干凈，接著用0.1%秋水仙素溶液進(jìn)行潤洗，再轉(zhuǎn)入0.1%秋水仙素溶液中處理，在4 ℃下保存24 h[35，36]。24 h后用去離子水洗凈，再用無水乙醇∶冰醋酸=3∶1的卡諾氏固定液在70%乙醇里保存，保存溫度4 ℃[37]。采用常規(guī)制片法和改良卡寶-品紅染色法進(jìn)行制片[38]，將制好的玻片放在顯微鏡下觀察染色體中期分裂情況，找出染色體數(shù)目清晰的視野，記錄染色體數(shù)目，拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 叢生芽誘導(dǎo)

試驗誘導(dǎo)出的湖北百合叢生芽情況分別見表1、圖1。從表1、圖1可見，誘導(dǎo)湖北百合鱗片不定芽的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，其叢生芽生長勢最好，較差的培養(yǎng)基是6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L。說明湖北百合叢生芽誘導(dǎo)與6-BA和NAA的濃度比密切相關(guān)，該比值直接影響叢生芽的數(shù)量和長勢。

2.2 多倍體誘變

秋水仙素不同濃度處理后對湖北百合芽誘變的影響情況分別見表2、圖2。由表2、圖2可見，經(jīng)秋水仙素處理后大部分叢生芽能夠正常生長，但也有異化生長和畸形死亡、葉片發(fā)黃及腐爛發(fā)生。得到存活率最高的秋水仙素最佳處理濃度是0.05%，其處理時間是24 h，存活率達(dá)90%；誘變率最高的秋水仙素處理濃度為0.10%，其處理時間是48 h，誘變率達(dá)20%，但隨處理濃度升高和處理時間延長死亡率增加。

2.3 外部形態(tài)觀察

秋水仙素處理對湖北百合外部形態(tài)的影響情況見圖2。從圖2可見，經(jīng)過處理后的植株其外部形態(tài)發(fā)生了較大的變化，如葉片寬厚、葉色加深、莖部變大，部分葉有反卷現(xiàn)象，根發(fā)生了膨大現(xiàn)象。

2.4 氣孔鑒定

對變異植株葉片和對照植株葉片的氣孔大小、形狀進(jìn)行觀察，結(jié)果見圖3。從圖3-1、圖3-2可見，在單位面積內(nèi)的變異植株和對照植株的氣孔及保衛(wèi)細(xì)胞的大小有明顯差異，而兩者的氣孔形狀無明顯差異，如對照植株氣孔長17.594 7 μm，而變異植株的氣孔長分別為（3個樣） 22.965 0、21.991 6、30.511 4 μm，后者的長、寬顯著大于對照。單位面積內(nèi)的變異植株保衛(wèi)細(xì)胞長、寬也顯著大于對照。因此，氣孔的鑒定可以作為湖北百合初步鑒定多倍體的一個重要間接指標(biāo)。單位面積內(nèi)對氣孔密度的測量及計算發(fā)現(xiàn)，變異植株的氣孔密度小于對照植株，對照的平均氣孔密度為67.61個/視野，變異植株的平均氣孔密度分別（3個樣）為52.95、51.81、43.36個/視野，顯示出經(jīng)過處理后的植株氣孔密度變小了。

2.5 染色體鑒定

根尖染色體鑒定結(jié)果見圖3。從圖3-3、圖3-4可見，對照植株（二倍體）根尖染色體數(shù)目為24條（2n=2x=24），變異植株（四倍體）染色體數(shù)目為48條（2n=4x=48）。馴化移栽結(jié)果顯示（圖3-5、圖3-6）。變異植株葉片變厚，葉色加深。

3 討論

不同配方培養(yǎng)基對百合叢生芽的誘導(dǎo)有很大的影響[39]。因此用不同的植物生長調(diào)節(jié)素配比分別進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)，篩選出最佳的培養(yǎng)基配方，可以在最短的時間內(nèi)獲得最多的叢生芽，這就為后續(xù)的百合無菌苗生產(chǎn)提供了大量的有用材料。本試驗篩選出來的最佳培養(yǎng)基配方與潘娟[2]研究的一致，但與楊毅等[6]的配方有所不同，可能是品種差異所致，但配方的可行性無疑。

利用化學(xué)藥劑誘變育種是一種快捷且有效的育種方法之一，誘變育種提供的新種質(zhì)資源為優(yōu)良品種的培育提供了更多的選擇[40，41]。試驗結(jié)果表明，湖北百合染色體加倍后，其植株形態(tài)明顯大于二倍體，但其營養(yǎng)價值是否得到提高有待進(jìn)一步試驗驗證。

秋水仙素是常用的多倍體誘變劑[12-17]；試驗采用棉球覆蓋法進(jìn)行處理，不同秋水仙素濃度梯度和時間梯度處理湖北百合均有不同程度的爛心現(xiàn)象出現(xiàn)。得到的最佳誘變濃度為秋水仙素溶液0.10%，處理時間48 h，誘變率高達(dá)20%，不過處理的濃度增大和時間延長對細(xì)胞的毒害作用也加大。其結(jié)果與劉靜[9]、王麗艷等[10]、張俊芳等[40]的試驗存在差異，其原因可能與品種差異有關(guān)，他們均采用栽培種百合作為外植體，而本試驗采用本地野生百合種作為外植體，野生種百合對藥劑的耐受性要強(qiáng)于栽培種百合，因此處理時間較長。離體誘變百合的方法通常有棉球覆蓋法、浸泡法[31]、混培法[42]等，浸泡法雖然能夠提高變異率，但對叢生芽的毒性很大，引起的死亡率和污染率較高；混培法的毒性小，但是誘變率不高，需二次轉(zhuǎn)接，所以污染率提高；棉球覆蓋法污染率較低，毒性較小，因此，本試驗采用此法，雖然有可能產(chǎn)生嵌合體[43]，但此次試驗在鑒定中尚未發(fā)現(xiàn)。

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