摘要：探討百草枯（PQ）對(duì)人肝細(xì)胞的毒性。采用甲基噻唑藍(lán)試驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)了PQ處理24 h對(duì)人肝HepG2細(xì)胞存活力和凋亡的影響。PQ處理24 h時(shí)，對(duì)HepG2細(xì)胞存活力的半數(shù)抑制濃度為51.17 mg/L；7.21 mg/L的PQ處理24 h即可啟動(dòng)HepG2細(xì)胞的早期凋亡程序，隨著PQ處理濃度的增大，HepG2細(xì)胞的總凋亡率先升高后降低，而細(xì)胞壞死率持續(xù)升高。PQ對(duì)人肝HepG2細(xì)胞具有明顯毒性，會(huì)抑制HepG2細(xì)胞的存活力，低濃度時(shí)主要誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，高濃度則主要導(dǎo)致細(xì)胞壞死，說(shuō)明保肝類(lèi)藥物可能對(duì)PQ中毒有較好療效。

關(guān)鍵詞：百草枯；HepG2細(xì)胞；甲基噻唑藍(lán)試驗(yàn)；流式細(xì)胞術(shù)；存活力；凋亡

中圖分類(lèi)號(hào)：R994.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）12-3088-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.12.023

Abstract： The cytotoxicity of paraquat （PQ） on human liver was explored comprehensively. Changes of viability and apoptosis were determined respectively by methyltetrazolium assay and flow cytometry in human hepatic HepG2 cells after 24 h PQ treatment. 24 h median inhibitory concentration of viability was 51.17 mg/L in HepG2 cells treated by PQ. Early apoptotic HepG2 cells were observed in 7.21 mg/L PQ treatment group. The total apoptotic rate of HepG2 cells went up at first and went down at last， but the necrotic rate kept a continuous increasing tendency with the increase of PQ treatment concentrations. PQ had a heavy toxicity on human hepatic HepG2 cells， inhibited cell viability， induced mainly cell apoptosis at a low concentration and cell necrosis at a high concentration， and which suggested liver protection drugs were possible to be effective for the treatment after PQ poisoning.

Key words： paraquat； HepG2 cell； methyltetrazolium assay； flow cytometry； viability； apoptosis

百草枯（Paraquat，PQ）是一種水溶型快速滅生性除草劑，因其易于被土壤吸附、在環(huán)境中殘留量相對(duì)較低和具有良好的除草效果，PQ先后在全球120多個(gè)國(guó)家60多種作物中被廣泛使用[1]。但自1962年注冊(cè)生產(chǎn)以來(lái)，這個(gè)使用量在全球僅次于草甘膦的除草劑已經(jīng)引起了嚴(yán)重的公共健康問(wèn)題，由PQ導(dǎo)致的生產(chǎn)和使用接觸而死亡的事件時(shí)有報(bào)道[2-4]。

通過(guò)對(duì)PQ中毒病人、死者和試驗(yàn)處理動(dòng)物進(jìn)行研究，人們發(fā)現(xiàn)體內(nèi)蓄積的PQ在肺內(nèi)沉積最多，PQ中毒之后往往首先導(dǎo)致呼吸衰竭[5-7]。此外，腎作為水溶物質(zhì)的排泄器官，其在PQ中毒之后發(fā)生的變化受到人們的廣泛關(guān)注[8，9]。近年來(lái)的慢性毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PQ引起的部分病理特征與一些衰老疾病癥狀相似，隨之PQ的神經(jīng)毒性被深入探討[10，11]。但PQ對(duì)其他器官的毒性報(bào)道較少，至今仍沒(méi)有針對(duì)PQ中毒的良好治療策略和高效解毒劑[12]，因此人們對(duì)PQ的毒性及機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍不完全。

眾所周知，肝是機(jī)體最重要的解毒器官，肝細(xì)胞在外源毒物的降解過(guò)程中往往發(fā)揮著舉足輕重的作用，因此，解讀肝細(xì)胞在PQ處理后發(fā)生的變化對(duì)全面理解PQ的毒性效應(yīng)及機(jī)制具有重要意義，有助于尋找新的方法提高肝對(duì)PQ的抵抗力、發(fā)揮肝對(duì)PQ中毒的解除功效，但PQ中毒對(duì)人肝細(xì)胞的影響并未受到足夠的關(guān)注。人肝癌細(xì)胞HepG2具有肝細(xì)胞的多種代謝和轉(zhuǎn)化酶系，是良好的肝細(xì)胞研究模型[13]。因此，本研究以人肝HepG2細(xì)胞作為試驗(yàn)材料，采用MTT和雙色流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)了PQ對(duì)HepG2細(xì)胞存活力和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用人肝HepG2細(xì)胞株由鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院贈(zèng)送。

PQ購(gòu)自美國(guó)Chem Service公司（1910-42-5），去離子水溶解備用；胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自杭州四季青公司（2104）；DMEM（Dulbecco′s modified eagle medium）培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司（30022.01B），試驗(yàn)中常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞用的培養(yǎng)液為90% DMEM+10% FBS的混合液；0.25%胰酶購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司（15050-057）；甲基噻唑藍(lán)（Methyltetrazolium，MTT）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所（C0009）；二甲基亞砜購(gòu)自美國(guó)Amresco公司（D8370）；異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記膜偶聯(lián)蛋白V（Annexin-V）和碘化丙啶（Propidium iodide，PI）雙色流式試劑盒購(gòu)自北京嘉美紐諾生物科技有限公司（LHK601-020），內(nèi)含Annexin-V FITC染液、PI染液、10×結(jié)合緩沖液，其中結(jié)合緩沖液用磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer solution，PBS）稀釋至1×。其他常規(guī)試劑均由河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)辦公室提供，分析純以上等級(jí)。

使用的主要儀器包括香港Heal Force公司生產(chǎn)的HF90型細(xì)胞培養(yǎng)箱、蘇州華宇凈化設(shè)備公司生產(chǎn)的SW-CJ-2F（D）型超凈工作臺(tái)、德國(guó)Leica公司生產(chǎn)的DMIL LED fluo型數(shù)碼倒置顯微鏡、美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn)的Multiskan酶標(biāo)儀、美國(guó)BD公司生產(chǎn)的FACS VerseTM型流式細(xì)胞儀（隨機(jī)配備有FACS上樣管和BD FACSuite分析軟件）。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代

一般情況下，人肝HepG2細(xì)胞以100 mm×20 mm單孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為37 ℃，二氧化碳含量為5%，箱底層存300 mL去離子水保持濕度。細(xì)胞傳代主要操作如下：①細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)取出培養(yǎng)板，PBS洗3次；②胰酶消化5 min，加PBS終止消化，輕輕吹吸貼壁細(xì)胞使之充分懸??；③細(xì)胞懸液移入離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞；④新鮮培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，吸取細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移入新的培養(yǎng)板；⑤輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板數(shù)次使HepG2細(xì)胞均勻鋪布板底面，作好標(biāo)記后置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 百草枯對(duì)HepG2細(xì)胞存活力的影響

采用MTT法檢測(cè)PQ對(duì)HepG2細(xì)胞存活力的影響[14]，以確定PQ對(duì)細(xì)胞的毒性劑量范圍。具體操作如下：①胰酶消化、收集指數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板，使待測(cè)細(xì)胞密度約5×104 個(gè)/孔；②培養(yǎng)細(xì)胞6 h后，加入0（正常組）、2、4、8、16、32、64、96 mg/L的PQ，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)6個(gè)復(fù)孔；③各孔加入10 μL 5 mg/mL MTT溶液，培養(yǎng)4 h；④吸棄各孔內(nèi)的液體，加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩約5 min，使生成的紫色結(jié)晶物充分溶解；⑤迅速拿到酶標(biāo)儀上，測(cè)量490 nm的吸光度，各PQ處理組吸光度與正常組吸光度之比即為PQ處理組細(xì)胞存活比率，以x±s表示，1-細(xì)胞存活比率=細(xì)胞存活力抑制率；⑥以PQ濃度為橫坐標(biāo)、細(xì)胞存活力抑制率為縱坐標(biāo)，Excel 2007作圖，擬合PQ處理濃度與細(xì)胞存活力抑制率的關(guān)系方程，由方程求出PQ對(duì)HepG2細(xì)胞存活力的半數(shù)抑制濃度（Median inhibitory concentration，IC50），依據(jù)IC50結(jié)果設(shè)定了細(xì)胞凋亡試驗(yàn)的PQ處理濃度（0、7.21、10.67、15.78、23.36、34.57 mg/L）。

1.4 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)百草枯對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

采用Annexin-V FITC和PI雙色流式細(xì)胞術(shù)[15]。具體操作如下：①將HepG2細(xì)胞分成0（雙陰性對(duì)照組）、25.59 mg/L（FITC單陽(yáng)性對(duì)照組）、51.17 mg/L（PI單陽(yáng)性對(duì)照組），0（正常組）、7.21、10.67、15.78、23.36、34.57 mg/L的PQ處理組（每組3個(gè)重復(fù)），處理24 h；②胰酶消化、收集細(xì)胞；③PBS洗1次，棄上清，加入300 μL的1×結(jié)合緩沖液，懸浮細(xì)胞；④加入5 μL的Annexin-V FITC（雙陰性和PI單陽(yáng)性對(duì)照組以PBS代替）混勻后，避光，室溫孵育15 min；⑤于流式細(xì)胞儀檢測(cè)前5 min加5 μL PI（雙陰性和FITC單陽(yáng)性對(duì)照組以PBS代替）；⑥上機(jī)檢測(cè)前補(bǔ)加400 μL的1×結(jié)合緩沖液，之后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至FACS管上機(jī)檢測(cè)，每板檢測(cè)20 000個(gè)細(xì)胞；⑦以BD FACSuite軟件對(duì)細(xì)胞進(jìn)行亞群分區(qū)作圖，并計(jì)數(shù)各亞群細(xì)胞數(shù)。以Excel 2007對(duì)各試驗(yàn)組不同亞群細(xì)胞比率（3個(gè)重復(fù)測(cè)定的x±s）作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 百草枯對(duì)HepG2細(xì)胞存活力的影響

以0、2、4、8、16、32、64、96 mg/L的PQ處理HepG2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞的存活力通過(guò)MTT試驗(yàn)進(jìn)行了檢測(cè)，細(xì)胞存活力隨PQ處理濃度變化的結(jié)果記錄于表1。由表1可看出，隨著PQ處理濃度的增大，HepG2細(xì)胞的存活力越來(lái)越弱。由表1可知，不同濃度PQ對(duì)HepG2細(xì)胞存活力的抑制率，二者關(guān)系見(jiàn)圖1，由圖1獲得的擬合曲線方程計(jì)算出PQ對(duì)HepG2細(xì)胞的24 h-IC50為51.17 mg/L。

2.2 百草枯對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

以BD FACSuite軟件對(duì)各試驗(yàn)組細(xì)胞進(jìn)行分析，其中9個(gè)試驗(yàn)組的每組20 000個(gè)HepG2細(xì)胞的前向角和側(cè)向角檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。在圖2中選擇密集且穩(wěn)定的細(xì)胞群定義為P1群，進(jìn)一步檢測(cè)P1群內(nèi)細(xì)胞的FITC和PI著色情況，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3-a、圖3-b和圖3-c分別顯示了FITC和PI雙陰性對(duì)照組、FITC單陽(yáng)性對(duì)照組和PI單陽(yáng)性對(duì)照組的P1細(xì)胞群結(jié)合FITC和PI的情況。根據(jù)該3個(gè)試驗(yàn)組細(xì)胞分布的規(guī)律可劃出十字門(mén)，十字門(mén)的左下（Lower left，LL）區(qū)域表示FITC和PI均為陰性，右下（Lower right，LR）區(qū)域表示FITC陽(yáng)性但PI陰性，右上（Up right，UR）區(qū)域表示FITC和PI均為陽(yáng)性，左上（Up left，UL）區(qū)域表示FITC陰性但PI陽(yáng)性。

LL區(qū)域?yàn)槲窗l(fā)生凋亡的健康細(xì)胞，其胞膜完整，F(xiàn)ITC和PI均不能結(jié)合于細(xì)胞上；LR區(qū)域?yàn)榘l(fā)生早期凋亡的細(xì)胞，該階段細(xì)胞胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸會(huì)外翻，因此可結(jié)合Annexin-V FITC；UR區(qū)域?yàn)橥砥诘蛲黾?xì)胞，Annexin-V FITC可結(jié)合于磷脂酰絲氨酸，PI可進(jìn)入細(xì)胞核錨定于核酸分子上，因此該類(lèi)細(xì)胞可同時(shí)顯出FITC和PI雙色；UL區(qū)域?yàn)閲?yán)重壞死細(xì)胞，PI分子可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)結(jié)合核酸分子，但磷脂酰絲氨酸結(jié)構(gòu)則可能已破壞，細(xì)胞無(wú)法結(jié)合Annexin-V FITC，因此僅顯示PI著色。

圖3-d、圖3-e、圖3-f、圖3-g、圖3-h和圖3-i分別表示正常組和7.21、10.67、15.78、23.36、34.57 mg/L的PQ處理組的P1細(xì)胞群結(jié)合FITC和PI的情況。以BD FACSuite軟件統(tǒng)計(jì)該6個(gè)試驗(yàn)組P1細(xì)胞群中LL、LR、UR和UL區(qū)域細(xì)胞的比率，即為該6組細(xì)胞中健康、早期凋亡、晚期凋亡和壞死的比率，如圖4所示。

由圖4可知，隨PQ處理濃度增加，各PQ處理組健康HepG2細(xì)胞比率呈持續(xù)下降趨勢(shì)，壞死HepG2細(xì)胞比率呈持續(xù)上升趨勢(shì)，與正常組相比，34.57 mg/L的PQ處理組的健康細(xì)胞比率下降了35.01%，而壞死胞上升至34.52%；同時(shí)，隨PQ處理濃度增加，凋亡早期和晚期的細(xì)胞比率均明顯表現(xiàn)為先上升后下降趨勢(shì)；此外，對(duì)凋亡細(xì)胞比率和死亡細(xì)胞比率數(shù)據(jù)進(jìn)行比較可見(jiàn)，在7.21、10.67、15.78 mg/L的PQ處理組，凋亡早期細(xì)胞比率即超過(guò)死亡細(xì)胞比率，而在23.36、34.57 mg/L的PQ處理組，凋亡早期和晚期細(xì)胞的總比率仍低于死亡細(xì)胞比率。綜合以上分析表明，低濃度的PQ處理主要導(dǎo)致HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡，而高濃度的PQ處理則主要導(dǎo)致HepG2細(xì)胞壞死。

3 小結(jié)與討論

近年來(lái)，關(guān)于PQ對(duì)人細(xì)胞的毒性試驗(yàn)受到密切關(guān)注，Izumi等[16]報(bào)道PQ對(duì)肝癌PC12細(xì)胞的48 h-IC50約為25.81 mg/L；Narasimhan等[17]檢測(cè)PQ對(duì)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞的24 h-IC50約為128.5 mg/L。本研究通過(guò)MTT法測(cè)知PQ對(duì)HepG2細(xì)胞的24 h-IC50約為51.17 mg/L。依據(jù)Izumi等[16]的試驗(yàn)結(jié)果，按照處理時(shí)間越長(zhǎng)IC50越低進(jìn)行推測(cè)，PQ對(duì)PC12的24 h-IC50應(yīng)該與本研究比較接近。這表明同為肝細(xì)胞株的HepG2與PC12對(duì)PQ的耐受力接近。比較Narasimhan等[17]、Izumi等[16]和本研究的PQ分別對(duì)神經(jīng)細(xì)胞和肝細(xì)胞的劑量-效應(yīng)關(guān)系可見(jiàn)，PQ的肝毒性強(qiáng)于神經(jīng)毒性。

參考檢測(cè)的PQ對(duì)HepG2細(xì)胞的24 h-IC50，本研究按1.48等比下降設(shè)計(jì)了一組處理濃度（7.21、10.67、15.78、23.36、34.57 mg/L）進(jìn)行凋亡試驗(yàn)，該組處理濃度保證了至少60%以上的HepG2細(xì)胞的存活力是正常的，這樣開(kāi)展試驗(yàn)不致于因PQ毒性過(guò)強(qiáng)直接導(dǎo)致細(xì)胞大批死亡而觀察不到毒性作用的細(xì)節(jié)。設(shè)計(jì)最高PQ濃度為34.57 mg/L時(shí)，其細(xì)胞活力不足65%，是為了確保處理濃度的PQ對(duì)HepG2細(xì)胞仍保持著較明顯的毒性，不致于因PQ毒性不足檢測(cè)不到相關(guān)指標(biāo)變化。

PQ對(duì)細(xì)胞凋亡的影響近幾年受到廣泛關(guān)注，其中多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為PQ促進(jìn)細(xì)胞凋亡，如Chang等[18]對(duì)胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，PQ可促進(jìn)凋亡因子P53和P51的表達(dá)，從而引發(fā)胚胎神經(jīng)干細(xì)胞凋亡；Garcia等[19]在多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞的試驗(yàn)中證實(shí)，PQ的處理抑制了細(xì)胞溶酶體水解酶和組織蛋白酶，使得自噬蛋白5依賴(lài)的細(xì)胞自噬增強(qiáng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加；此外，Hong等[20]在其研究中認(rèn)為，環(huán)木菠蘿烯醇阿魏酸酯可通過(guò)抑制Nrf2信號(hào)通路關(guān)鍵分子Nrf2、HO1和NQO1表達(dá)的途徑挽救PQ誘導(dǎo)的腎小球近端小管HK-2細(xì)胞的凋亡；Omura等[21]發(fā)現(xiàn)?；敲撗跄懰徕c可作為分子伴侶改變未折疊蛋白的表達(dá)水平，從而緩解PQ引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激壓力導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。但Wang等[22]指出PQ不會(huì)導(dǎo)致中性粒細(xì)胞凋亡，PQ中毒后產(chǎn)生的活性氧可活化中性粒細(xì)胞的核因子-κB、促細(xì)胞分裂原激酶p38和骨髓細(xì)胞增殖因子-1，從而延長(zhǎng)中性粒細(xì)胞的生命周期，同時(shí)，中性粒細(xì)胞不斷產(chǎn)生促炎因子如白介素-6和腫瘤壞死因子-α導(dǎo)致組織細(xì)胞產(chǎn)生更多的活性氧，該惡性循環(huán)不斷發(fā)展最終造成機(jī)體組織病變、器官衰竭。

本研究首次采用Annexin-V FITC和PI雙色流式細(xì)胞術(shù)同步檢測(cè)細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸的易位和膜的通透性2個(gè)凋亡指標(biāo)的改變發(fā)現(xiàn)，低濃度的PQ （7.21 mg/L）即可明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞發(fā)生早期凋亡，中等濃度（10.67 mg/L和15.78 mg/L）的PQ可大量促進(jìn)HepG2細(xì)胞發(fā)生早期或晚期凋亡，高濃度（23.36 mg/L和34.57 mg/L）的PQ可促進(jìn)HepG2細(xì)胞大量死亡，該結(jié)果與Chang等[18]、Garcia等[19]、Hong等[20]和Omura等[21]的結(jié)論一致，即證實(shí)PQ會(huì)誘導(dǎo)人細(xì)胞發(fā)生凋亡，不同之處是首次證明了PQ對(duì)肝細(xì)胞的促凋亡作用。此外，本試驗(yàn)存活力和凋亡檢測(cè)的結(jié)果均表明，高濃度PQ對(duì)HepG2細(xì)胞的24 h致死性較強(qiáng)，這在一定程度上解釋了PQ毒性研究多年始終沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有效療法或解毒劑的原因，即PQ中毒后，在解毒過(guò)程中起決定性作用的肝細(xì)胞本身發(fā)生了故障，機(jī)體內(nèi)在的解毒能力可能已嚴(yán)重喪失或解毒生理反應(yīng)難以發(fā)生，這提示保肝類(lèi)藥物可能對(duì)PQ中毒會(huì)具有較好的療效。

綜上所述，PQ對(duì)人肝HepG2細(xì)胞的存活力有抑制作用，其中，51.17 mg/L的PQ處理可導(dǎo)致HepG2細(xì)胞的存活力被半數(shù)抑制。PQ可誘導(dǎo)人肝HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡，7.21 mg/L的PQ處理即可啟動(dòng)細(xì)胞的早期凋亡程序，在低濃度的PQ處理組，HepG2細(xì)胞凋亡率隨PQ處理濃度增大而升高，但高濃度的PQ處理組HepG2細(xì)胞的凋亡率降低、壞死率升高。因此，PQ中毒之后，人肝的解毒能力將會(huì)下降，選擇保肝類(lèi)藥物治療可能有利于提高肝對(duì)PQ的抵抗力、增強(qiáng)肝對(duì)PQ的解毒功效，從而緩解機(jī)體的中毒癥狀。

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