李 娟，劉曉紅，宋 潔，李 莉

(1.遼東學院 農(nóng)學院，遼寧 丹東 118003；2.遼東生物產(chǎn)業(yè)研究所，遼寧 丹東 118003)

人工栽培蛹蟲草致病木霉CCBH-M2的鑒定及生物學特性

李 娟1, 2，劉曉紅1, 2，宋 潔1, 2，李 莉1

(1.遼東學院 農(nóng)學院，遼寧 丹東 118003；2.遼東生物產(chǎn)業(yè)研究所，遼寧 丹東 118003)

自人工栽培蛹蟲草培養(yǎng)料中分離得到1株致病木霉CCBH-M2，通過對其進行形態(tài)學鑒定及ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析，確定該木霉菌株為鉤狀木霉Trichodermahamatum(Bon.)Bain.。實驗對該致病菌進行了生物學特性研究，結(jié)果表明，溫度、pH值及培養(yǎng)料含水量對該鉤狀木霉生長影響顯著(P<0.05)，其最適生長溫度為26 ℃，最適pH值為6.0，培養(yǎng)料最適含水量為50 %～60 %。該研究結(jié)果是鉤狀木霉對人工栽培蛹蟲草具有致病性的首次報道。

蛹蟲草；致病木霉；鉤狀木霉；生物學特性

蛹蟲草Cordycepsmilitaris(L.: Fr.)Link，屬蟲草科Cordycipitaceae，蟲草屬Cordyceps[1]，是珍貴的食藥用真菌。該菌含蟲草素、多糖、蟲草酸、超氧化物歧化酶等多種生物活性成分，具有抗腫瘤、抑菌、提高免疫力、清除自由基等功效[2]。蛹蟲草子實體已經(jīng)實現(xiàn)規(guī)?；斯ぴ耘?，然而在栽培過程中，常發(fā)生病害。食用菌病害是指在栽培過程中，食用菌受到其他有害微生物的侵染，其正常的生長發(fā)育受到影響和抑制，導致菌絲體和子實體異常甚至死亡，對食用菌生產(chǎn)造成損失的現(xiàn)象，引起食用菌病害的微生物主要包括真菌、細菌及病毒[3]。

木霉TrichodermaPers.屬于半知菌類的絲孢綱Hyphomycetes，絲孢目Hyphomycetales，叢梗孢科Moniliaceae，其有性階段若發(fā)現(xiàn)一般為子囊菌門Ascomycota，肉座菌目Hypocreales，肉座菌科Hypocreaceae的肉座菌屬HypocreaFr.[4-5]。木霉是香菇、平菇、金針菇、木耳等食用菌生產(chǎn)中主要的競爭性雜菌和病原菌，對多種食用菌子實體具有很強的寄生性，常在食用菌的制種和栽培過程中污染培養(yǎng)料和菌絲體，影響產(chǎn)品質(zhì)量并造成減產(chǎn)[6]。根據(jù)調(diào)查，木霉亦是蛹蟲草栽培過程中的常見真菌病害，一旦發(fā)病會造成減產(chǎn)，甚至絕收。但至今尚未見關(guān)于蛹蟲草木霉病害病原菌的系統(tǒng)研究報道。

本文自被木霉侵染的蛹蟲草栽培料中分離木霉菌株，根據(jù)形態(tài)學特征和ITS序列分析確定其種屬，并研究了溫度、pH值和培養(yǎng)料含水量對木霉菌株生長的影響，以期為該菌的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株 木霉菌株CCBH-M2分離自遼寧省丹東市金山蟲草合作社感染木霉的蛹蟲草栽培盒，現(xiàn)保存于遼東學院農(nóng)學院微生物學實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g、葡萄糖10.0 g、瓊脂20.0 g、水1000 mL；小麥培養(yǎng)基：小麥70 %、蠶蛹粉23 %、蔗糖5 %、蛋白胨1.5 %、酵母粉 0.5 %、VB1微量、含水量60 %。

1.1.3 分子生物學試劑 真菌基因組DNA快速抽提試劑盒、引物ITS1/ITS4、TaqPCR Master Mix (2x，without dye)、DNA Marker(D2000)、6×loading bufffer均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 菌株CCBH-M2的形態(tài)學鑒定 將木霉菌株CCBH-M2活化后，用直徑0.6 cm的打孔器制備菌餅，接種至PDA平板中央，28 ℃培養(yǎng)5 d，每天觀察菌落形態(tài)、顏色等性狀。采用插片法培養(yǎng)菌株CCBH-M2，具體方法為：在距離菌餅2 cm處，將滅菌蓋玻片以45°角插入培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)。5 d后用鑷子取出蓋玻片，有菌面朝上置于載玻片上，顯微鏡下觀察孢子、分生孢子梗及瓶梗的形態(tài)特征。按照楊合同[7]的分類方法對菌株進行形態(tài)學鑒定。

1.2.2 菌株CCBH-M2的ITS序列分析 參照潘力[8]方法培養(yǎng)菌株CCBH-M2獲得菌絲體，按照基因組DNA快速抽提試劑盒的步驟要求提取木霉菌株的基因組DNA，采用通用引物(ITS1: 5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCGG- 3’；ITS4：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC- 3’)進行ITS序列的PCR擴增，擴增體系(50 μl)：1×TaqPCR Master Mix 25 μl，DNA模板2 μl(0.1～10 ng)，引物(10 μmol/L)各2 μl，ddH2O 19 μl。PCR反應條件為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應。擴增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測后于-20 ℃冰箱保存，送至生工生物工程(上海)有限公司進行純化，雙向測序并拼接輸出全序列。通過NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫中的Blast檢測并下載已測序列的相似序列和參考序列，運用ISTH(www.isth.info)數(shù)據(jù)庫中的TrichOKey2.0[9]檢測下載序列的準確性。運用軟件ClustalX(Version 1.83)對多序列進行比對。運用分析軟件Mega6.06中的鄰位相連法進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

1.2.3 菌株CCBH-M2的生物學特性研究 (1)溫度對菌株CCBH-M2生長的影響：菌株CCBH-M2在PDA平板活化后，用直徑0.6 cm的無菌打孔器制備菌餅，接種至直徑9.0 cm的PDA平板中央，分別置于20、24、26、28、30、32、35、40 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個處理設(shè)3個重復。培養(yǎng)5 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

(2)pH值對菌株CCBH-M2生長的影響： PDA培養(yǎng)基滅菌前用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)整pH值分別至2、3、4、5、6、7、8、9、10。按照(1)中的方法接種木霉菌株CCBH-M2，在最適溫度下培養(yǎng)，每個處理設(shè)3個重復。5 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

(3)培養(yǎng)料含水量對菌株CCBH-M2生長的影響：培養(yǎng)料為小麥培養(yǎng)基，按照吳小平[10]的方法，先將小麥烘干，再按比例加水拌料，配制成含水量分別為45 %、50 %、55 %、60 %、65 %、70 %、75 %的培養(yǎng)料，自然pH值，等量分裝于20 mm×200 mm的試管中，滅菌后接種木霉菌株CCBH-M2，在最適溫度下培養(yǎng)，每個處理設(shè)3個重復。5 d后測量試管中菌絲生長前端至培養(yǎng)料表面的距離，計算菌絲生長速度。

儒家思想之內(nèi)涵、處事原則及方式，無不體現(xiàn)著對經(jīng)與權(quán)的闡釋。權(quán)，從字面意思來理解是變化，似乎與原則相悖，但卻是對經(jīng)的完美補充，于是便有君子之中庸，有經(jīng)有權(quán)，小人反中庸。權(quán)，這一尺度生于人心權(quán)衡機能，生成固定之經(jīng)后，又可以反過來幫助人在具體情境中進行尺度的判斷和運用。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)整理及作圖采用Excel(Word2003)。運用軟件SPSS 18.0對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，差異顯著性分析采用鄧肯氏新復極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

菌株CCBH-M2的侵染主要出現(xiàn)在蛹蟲草栽培的轉(zhuǎn)色提溫階段。發(fā)病初期，被木霉菌株CCBH-M2侵染的蛹蟲草培養(yǎng)料長出白色菌絲，生長較快。5～7 d后，病原菌產(chǎn)生黃綠色孢子，菌絲和孢子覆蓋整個培養(yǎng)料。蛹蟲草菌絲和子實體的生長完全被病原菌抑制，導致子實體難以形成或子實體矮小畸形，采收期蛹蟲草子實體出現(xiàn)倒伏，造成產(chǎn)量大減。

圖1 菌株CCBH-M2的菌落形態(tài)Fig.1 Colony of strain CCBH-M2

圖2 菌株CCBH-M2的分生孢子梗及瓶梗(×400)Fig.2 Conidiophores and phialides of strain CCBH-M2

圖3 菌株CCBH-M2的分生孢子(×1000)Fig.3 Conidia of strain CCBH-M2

2.2 菌株CCBH-M2的形態(tài)特征

菌株CCBH-M2在PDA平板上，生長較慢，菌落呈白色，菌絲稀疏，7～10 d后產(chǎn)生黃綠色分生孢子，菌落背面無色(圖1)。

圖4 菌株CCBH-M2的ITS 序列PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.4 ITS amplification electrophoresis of strain CCBH-M2

分生孢子梗具不規(guī)則分枝，波狀彎曲，明顯延長成不育枝，瓶梗橢球形，分生孢子黃綠色，表面光滑，橢圓形，3.8～4.0 μm×2.2～2.5 μm(圖2～3)。

對照《木霉分類與鑒定》[7]及孫軍[11]和張廣志[12]的木霉分類檢索表，菌株CCBH-M2的形態(tài)學特征與已知的鉤狀木霉Trichodermahamatum(Bon.)Bain.一致，故將其初步鑒定為鉤狀木霉。

2.3 菌株CCBH-M2的ITS序列分析

以菌株CCBH-M2的基因組DNA為模板，對其ITS片段進行PCR擴增，獲得600 bp左右的特異性片段(圖4)。經(jīng)測序并拼接，獲得長度為561 bp的堿基序列(圖5)。將所測序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast序列檢索，運用ISTH數(shù)據(jù)庫中的TrichOKey2.0對下載序列的準確性進行檢測。選取其中5個準確、典型菌株的ITS序列，以產(chǎn)黃青霉PenicilliumchrysogenumThom和白地霉geotrichumcandidumLink為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行系統(tǒng)發(fā)育分析(圖6)。結(jié)果表明，菌株CCBH-M2與T.hamatum聚類在一個分支上。因此，結(jié)合形態(tài)特征及ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將菌株CCBH-M2鑒定為鉤狀木霉T.hamatum。

圖5 菌株CCBH-M2的ITS 序列Fig.5 ITS sequence of strain CCBH-M2

圖6 基于菌株CCBH-M2 ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of CCBH-M2and related strains

圖7 不同溫度對菌株CCBH-M2生長的影響Fig.7 Effects of different temperature on strain CCBH-M2

2.4 菌株CCBH-M2的生物學特性

2.4.1 溫度對菌株CCBH-M2生長的影響 圖7表明，溫度對其生長影響顯著(P<0.05)，菌株CCBH-M2的菌落直徑隨著溫度的升高呈現(xiàn)先增長后降低的趨勢，當溫度為40 ℃時，該菌的生長完全受到抑制。在26 ℃下菌株CCBH-M2菌落直徑顯著大于其它處理組(P<0.05)，表明該菌的最適生長溫度為26 ℃。

2.4.2 pH值對菌株CCBH-M2生長的影響 如圖8所示，pH對菌株CCBH-M2的生長影響顯著(P<0.05)，其菌落直徑隨著pH值的升高同樣表現(xiàn)出先增大后降低的趨勢，當pH值為6時，菌落直徑顯著高于其它處理組(P<0.05)，表明該菌的最適生長pH值為6，喜微酸環(huán)境。

2.4.3 培養(yǎng)料含水量對菌株CCBH-M2生長的影響 從圖9可知，培養(yǎng)料含水量在50 %～60 %，測試菌株具有較高的生長速度，且此范圍內(nèi)各組間差異不顯著(P>0.05)，此范圍即為木霉菌株CCBH-M2培養(yǎng)料的最適含水量。當含水量過低(45 %)和過高(>70 %)時菌絲生長較慢，且試驗過程中觀測到含水量低產(chǎn)孢量大，含水量高產(chǎn)孢能力下降。

圖8 不同pH值對菌株CCBH-M2生長的影響Fig.8 Effects of different pH value on strain CCBH-M2

圖9 培養(yǎng)料含水量對菌株CCBH-M2生長的影響Fig.9 Effects of different water content on strain CCBH-M2

3 討 論

據(jù)報道，危害香菇、平菇、金針菇、木耳等食用菌的木霉種類主要包括綠色木霉TrichodermaviridePers.、深綠木霉T.atroviride、康氏木霉T.koningiiOudem、哈茨木霉TrichodermaharzianumRifai、棘孢木霉TrichodermasperellumSamuels，Lieckfeldt & Nirenberg等[6,10,13～15]，而對蛹蟲草致病木霉的研究則至今尚未見相關(guān)報道。本研究自人工栽培蛹蟲草培養(yǎng)料中分離到一株致病木霉，結(jié)合形態(tài)學特征和ITS序列分析確定其為鉤狀木霉。在對該菌進行ITS序列分析時，常規(guī)的方法是利用NCBI提供的搜索工具BLAST進行相似序列檢索，但該方法對木霉種類鑒定存在明顯的缺陷，因為該數(shù)據(jù)庫中大約40 %的木霉種類未經(jīng)鑒定確認，或者在種的水平上鑒別錯誤[16]。因此，通過該方法獲得的相似序列可信度低。而ISTH數(shù)據(jù)庫是國際真菌分類委員會(國際微生物學會聯(lián)合會)的木霉專門委員會利用修訂和確認的序列數(shù)據(jù)建立了一個全自動的木霉種類鑒定方法[4]。本研究將Blast獲得相似序列，通過ISTH數(shù)據(jù)庫中的TrichOKey2.0進行準確性測定后，結(jié)合兩個數(shù)據(jù)庫的信息，選取準確典型的序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，從而對木霉菌株進行可靠的鑒定。

鉤狀木霉的生物學特性研究顯示，其生長的最適溫度為26 ℃，最適pH值為6.0，最適培養(yǎng)料含水量為50 %～60 %?？梢姼邷亍⒏邼窦叭跛嵝原h(huán)境利于該菌的生長，因此該病原菌易發(fā)生于蛹蟲草栽培的轉(zhuǎn)色提溫階段。本研究結(jié)果為蛹蟲草生產(chǎn)栽培過程中對該致病菌采取有效的防治措施提供了重要的理論依據(jù)。

[1]張 姝, 張永杰, SHRESTHA Bhusha, 等. 冬蟲夏草菌和蛹蟲草菌的研究現(xiàn)狀、問題及展望[J]. 菌物學報, 2013, 32(4):577-597.

[2]楊 濤, 董彩虹. 蟲草素的研究開發(fā)現(xiàn)狀與思考[J]. 菌物學報, 2011, 30: 180-190.

[3]黃年來. 食用菌病蟲診治手冊[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2001: 70-174.

[4]張廣志, 楊合同, 張新建, 等. 木霉現(xiàn)有種類名錄[J]. 菌物學報, 2014,33(6): 1210-1230.

[5]朱兆香, 莊文穎. 木霉屬研究概況[J]. 菌物學報, 2014, 33(6):1136-1153.

[6]邵凌云, 師迎春, 國立耘. 北京地區(qū)食用菌上木霉污染菌的種類鑒定[J].食用菌學報, 2008, 15(1): 86-90.

[7]楊合同. 木霉分類與鑒定[M]. 北京: 中國大地出版社, 2009: 71-325.

[8]潘 力, 崔 翠, 王 斌. 種用于PCR擴增的絲狀真菌DNA快速提取方法[J]．微生物學通報, 2010, 37(3): 450-453.

[9]Kopchinskiy A, Komon M, Kubicek C P, et al. TrichoBLAST: a multiloci database of phylogenetic markers forTrichodermaandHypocreapowered by sequence diagnosis and similarity search tools[J]. Mycological Research News, 2005, 109: 658-660.

[10]吳小平. 食用菌致病木霉的鑒定、致病機理及防治研究[D]. 福建農(nóng)林大學, 2008: 23-32.

[11]孫 軍, 段玉璽, 呂國忠. 遼寧木霉屬Trichoderma真菌的形態(tài)分類研究[J]. 菌物研究, 2006, 4(2): 38-44.

[12]張廣志, 楊合同, 文成敬. 木霉菌形態(tài)學分類檢索與分子生物學鑒定[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版), 2011, 42(2): 309-316.

[13]陳艷露. 平菇木霉病的病原鑒定及其防治研究[D]. 廣西大學, 2013: 19-26.

[14]程麗云, 葉明珍, 張紹升. 食用菌木霉病的病原鑒定[J]. 亞熱帶農(nóng)業(yè)研究, 2006, 2(1): 41-44.

[15]王 琪. 香菇木霉病菌的鑒定及室內(nèi)生物制劑篩選[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學, 2010, 38(7): 117-118.

[16]Druzhinina I S, Kopchinskiy A G, Kubicek C P. The first 100Trichodermaspecies characterized by molecular data[J]. Mycoscience, 2006, 47: 55-64.

(責任編輯 李 潔)

Identification of PathogenicTrichodermaCCBH-M2 from CultivatedCordycepsmilitarisand Its Biological Characteristics

LI Juan1, 2, LIU Xiao-hong1, 2, SONG Jie1, 2, LI Li1

(1. Agricultural College, Eastern Liaoning University, Liaoning Dandong 118003, China；2. Institute of Applied Biology, Eastern Liaoning University, Liaoning Dandong 118003, China)

A pathogenicTrichodermastrain CCBH-M2 was isolated from culture material of cultivatedCordycepsmilitaris. The morphological characteristics and phylogenetic analysis showed that strain CCBH-M2 wasTrichodermahamatum(Bon.)Bain. The biological characteristics ofT.hamatumwere studied and the results showed that temperature, pH value and water content of the culture medium significantly influenced the growth of strain CCBH-M2(P<0.05), and its optimum growth temperature was 26 ℃, the optimum pH value was 6.0 and the optimum water content of culture materials was 50 %-60 %. The result was the first report ofT.hamatumpathogenicity on cultivatedC.militaris.

Cordycepsmilitaris; PathogenicTrichoderma;Trichodermahamatum; Biological characteristics

1001-4829(2016)09-2216-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.09.035

2015-10-12

遼寧省教育廳科學研究一般項目 (L2012472)；丹東市科學技術(shù)計劃項目(農(nóng)業(yè)公關(guān)及產(chǎn)業(yè)化)(201402)

李 娟(1980-)，女，遼寧朝陽人，博士，講師，主要從事食用菌栽培及病害防治，E-mail: smilejuanzili@sina.com。

S646.9

A