陳敬國(guó)+鄂桂娟+方慧云

【中圖分類(lèi)號(hào)】R615 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2095-6851（2016）12-0-01

巢蛋白表達(dá)最初開(kāi)始于胚胎早期的神經(jīng)前體細(xì)胞，在胚胎腦中主要以時(shí)空序列的方式進(jìn)行表達(dá)，當(dāng)前巢蛋白已經(jīng)成為神經(jīng)肝細(xì)胞的標(biāo)記蛋白，常常被用于神經(jīng)干細(xì)胞的分離、鑒定以及培養(yǎng)中[1]。巢蛋白 mRNA 在哺乳類(lèi)動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的表達(dá)具有區(qū)域相關(guān)性，其表達(dá)的強(qiáng)弱可反映某些區(qū)域內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的增殖活性[2]。本文筆者運(yùn)用采用RT-PCR方法對(duì)臍血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)前后及馬錢(qián)子誘導(dǎo)培養(yǎng)后巢蛋白mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，現(xiàn)將試驗(yàn)方法和試驗(yàn)結(jié)果簡(jiǎn)單匯報(bào)如下：

1.資料與方法

1.1 材料

1.1.1 臍血來(lái)源。臍血主要是用肝素抗凝采血袋從本院產(chǎn)科無(wú)菌收集健康產(chǎn)婦足月妊娠順產(chǎn)或剖宮產(chǎn)的嬰兒臍帶血50～100ml，性別不限，均獲得產(chǎn)婦極其家屬同意用于科研中，并且獲得我院倫理委員會(huì)的同意，簽署了知情同意書(shū)，所有產(chǎn)婦均身體健康、無(wú)結(jié)核、肝炎、獲得性免疫缺陷綜合癥、梅毒等傳染病，新生兒均無(wú)先天性畸形。將臍血充分混勻后，置保溫盒中。

1.1.2 主要試劑。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。新生牛血清：杭州四季青生物工程材料研究所產(chǎn)品。淋巴細(xì)胞分離液（1.077 g/cm3）：天津血液病研究所產(chǎn)品。瓊脂糖為Sigma公司產(chǎn)品。RNA提取試劑盒為上海生物工程公司產(chǎn)品，RevertAidTM First StrandcDNA Synthesis Kit為MBI Fermentas公司產(chǎn)品。其他PCR試劑均購(gòu)自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 臍血MNCs的分離方法。密度梯度離心法分離臍血MNCs。用酒精棉球擦拭采血袋的塑料導(dǎo)管，以無(wú)菌手術(shù)剪刀剪斷塑料管，然后將血袋內(nèi)的抗凝臍血導(dǎo)入一250 ml無(wú)菌生理鹽水瓶中，用無(wú)菌的PBS（pH7.0）等體積稀釋?zhuān)p輕震蕩搖勻。取數(shù)個(gè)50 ml的無(wú)菌帶蓋離心管，先加入1.077 g/cm3的淋巴細(xì)胞分離液20～25 ml，無(wú)菌吸管吸取稀釋后的臍血25～30ml，離液面約1 cm處緩慢加入，應(yīng)形成一明顯的界面，上下液體勿混合。2 000 r/min離心25 min，小心吸取中間的白膜層。加入7～10倍體積的PBS緩沖液，1 000 r/min、10 min離心洗滌3次，棄上清。所得MNCs經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色、光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整至適當(dāng)細(xì)胞密度用于細(xì)胞培養(yǎng)，并凍存部分細(xì)胞于液氮中備用[3]。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與收集 以1.0×106ml-1（T-25培養(yǎng)瓶）的密度接種于含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，每3 d換液1次。15 d后，培養(yǎng)物在200 r/min搖動(dòng)約30min，收集、離心洗滌細(xì)胞；將凍存的未培養(yǎng)的細(xì)胞解凍、離心洗滌。在顯微鏡下，臺(tái)盼藍(lán)染色、計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度備用。另一組細(xì)胞加用馬錢(qián)子粉。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成 采用相關(guān)軟件設(shè)計(jì)RT-PCR引物。nestin引物（上游引物N1：5-AGG ATG TG AGGTAGTGAGA-3，下游引物N2：5-TGGAGATCTCAGTGG CTCTT-3），內(nèi)對(duì)照β-actin引物（上游引物A1： 5-GGC ATG GGT CAG AAG GATTCC-3，下游引物A2：5-ATGTCA CGC ACG ATTTCC CGC-3）。均由上海生物工程公司合成。

1.2.4 RT-PCR RNA提取及cDNA合成參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。在完成cDNA合成之后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在Ependoff管中依次加入下列物質(zhì)：10 mmol/L 4×dNTP 1 ml，Taq酶0.5 ml （5 u/ml）， cDNA5 ml，特異性引物1、2各1 ml，內(nèi)對(duì)照引物0.3 ml， 10×緩沖液5 ml， ddH2O36.2 ml。PCR擴(kuò)增條件為：94℃1 min， 94℃30 s，57℃30 s，72℃30 s，40個(gè)循環(huán)后，72℃延伸7 min。

1.2.5 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè) 取10ml加有載樣緩沖液的擴(kuò)增產(chǎn)物加樣至含有溴化乙錠（EB）、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖凝膠中，在電壓5～10 V/cm下電泳60min后，置紫外透射儀下觀測(cè)結(jié)果，并利用凝膠掃描成像系統(tǒng)照相[4]。

2.結(jié)果

2.1 臍帶MNCs的形態(tài)極其活性

每一根臍帶分離到的MNCs數(shù)量為（4.13—6.41）×105個(gè)/L，細(xì)胞的活性高達(dá)96.71%—99.72%。運(yùn)用倒置相差顯微鏡進(jìn)行觀察，新鮮分離出來(lái)的MNCs胞體表現(xiàn)為圓形，將其接種大約48小時(shí)左右，有近25%的細(xì)胞由圓形變成了梭形，并且細(xì)胞開(kāi)始貼壁，在72小時(shí)偶貼壁細(xì)胞的數(shù)量不斷增多，而發(fā)生細(xì)胞形態(tài)變化明顯，最終表現(xiàn)為長(zhǎng)梭形，彼此之間緊密排列在儀器。在細(xì)胞培養(yǎng)10天后，可以看到1-2個(gè)HP胞體較大，還可以發(fā)現(xiàn)一些放射狀的突觸神經(jīng)樣細(xì)胞，并且各個(gè)細(xì)胞表現(xiàn)的形態(tài)也不盡相同，具體如圖1所示。在培養(yǎng)30天后，細(xì)胞表現(xiàn)出不規(guī)律生長(zhǎng)，因此無(wú)法根據(jù)其形態(tài)進(jìn)行判斷。

2.2 臍帶血源MNCs巢蛋白的mRNA表達(dá)分析

具體表達(dá)情況如如圖2所示。沒(méi)有培養(yǎng)的原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞的巢蛋白mRNA均表現(xiàn)為陽(yáng)性，原代細(xì)胞巢蛋白的mRNA相對(duì)表達(dá)量為2.64±0.42，第一代細(xì)胞的表達(dá)量為1.71±0.19，第二代細(xì)胞的表達(dá)量為0.26±0.06。

3.討論

巢蛋白在多器官、多細(xì)胞均有分布，尤以胚胎期分布為廣泛，目前已可在胚胎干細(xì)胞可分化的幾乎所有類(lèi)型的組織細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)表達(dá)，如神經(jīng)系統(tǒng)、胰腺、肝臟、心肌、骨骼肌、牙齒、腎上腺、發(fā)囊、皮膚、睪丸和胃腸道及多系統(tǒng)腫瘤均有分布。王軍[5]等學(xué)者經(jīng)過(guò)試驗(yàn)證實(shí)臍帶中的MNCs總量常常高于血液和羊水中的總量，跟骨髓血中提取的MNCs比較相似，都具有多向分化的功能，這跟國(guó)外Lee[6]等學(xué)者的研究結(jié)果一致。

馬錢(qián)子原名番木鱉，為馬錢(qián)科馬錢(qián)子屬植物馬錢(qián)及云南馬錢(qián)的干燥成熟種子。臨床應(yīng)用非常廣泛，化學(xué)成分含有多種生物堿，番木鱉堿（即士的寧）為馬錢(qián)子的最主要成分。約占總生物堿的45%。士的寧對(duì)整個(gè)中樞系統(tǒng)都有興奮作用。首先興奮脊髓的反射機(jī)能，其次興奮延髓的呼吸中樞及血管運(yùn)動(dòng)中樞，并能提高大腦皮質(zhì)的感覺(jué)中樞機(jī)能。小劑量的士的寧能加強(qiáng)皮質(zhì)的興奮過(guò)程，促使處于抑制狀態(tài)的患者蘇醒，還能提高味覺(jué)，觸覺(jué)，聽(tīng)覺(jué)和視覺(jué)等感官器官的功能。

在本文中，筆者運(yùn)用采用RT-PCR方法對(duì)臍血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)前后及馬錢(qián)子誘導(dǎo)培養(yǎng)后巢蛋白mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)來(lái)探討馬錢(qián)子對(duì)臍血原性神經(jīng)干細(xì)胞巢蛋白mRNA表達(dá)產(chǎn)生的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，臍血MNCs呈巢蛋白mRNA陽(yáng)性表達(dá)，并且其表達(dá)量在傳代后數(shù)量明顯減少.該研究結(jié)果跟烏優(yōu)圖，王運(yùn)杰[7]等研究結(jié)果一致。但是這并非意味著細(xì)胞中神經(jīng)前體細(xì)胞的數(shù)量在減少，其主要是因?yàn)椋菏紫壬鲜鲎兓驳鞍自谏窠?jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化時(shí)表現(xiàn)出來(lái)的變化是一致的，其次是發(fā)生的該變化可能跟細(xì)胞的橫向分化存在關(guān)聯(lián)。有研究指出[8]：臍血細(xì)胞在培養(yǎng)8天后能夠發(fā)現(xiàn)少數(shù)表現(xiàn)出放射狀突起類(lèi)似神經(jīng)樣細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)，這些突出的形態(tài)跟樹(shù)突、軸突等形態(tài)相似，即便在傳代以后，依然有類(lèi)似的細(xì)胞產(chǎn)生，但是在傳代5次之后，絕大部分的細(xì)胞表現(xiàn)為表皮樣生長(zhǎng)或者無(wú)規(guī)則形態(tài)生長(zhǎng)，無(wú)法找到神經(jīng)樣細(xì)胞，這對(duì)這種情況可能是MNCs自發(fā)分化成神經(jīng)前體細(xì)胞導(dǎo)致的，但是這些神經(jīng)樣細(xì)胞在移植之后是否能夠表現(xiàn)出神經(jīng)元功能還有待研究。

綜上所述，利用無(wú)菌的產(chǎn)婦足月妊娠順產(chǎn)或剖宮產(chǎn)的嬰兒臍帶血分離培養(yǎng)的原代細(xì)胞具有巢蛋白mRNA的表達(dá)，并且其傳代以后的基因也依然有表達(dá)，如此便證實(shí)了其具有分化成神經(jīng)細(xì)胞的潛能，雖然在傳代之后的數(shù)量有一定程度減少，但是依然可以作為穩(wěn)定、可靠的細(xì)胞供體，不僅如此，根據(jù)MNCs培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)的各種形態(tài)的類(lèi)神經(jīng)樣細(xì)胞，如此便證實(shí)了MNCs中可能存有一定的神經(jīng)前體細(xì)胞，并且該細(xì)胞今后還有可能成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的種子細(xì)胞之一。

參考文獻(xiàn)

[1]齊凱，董麗媛，陳顯久.人臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的優(yōu)化[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù). 2011.15（23）4220-4224.

[2]陳海，王軍，范亞珍，等. 人臍血源性神經(jīng)干細(xì)胞中Nestin基因的表達(dá)及意義[J].實(shí)用兒科臨床雜志，2010，25（19）：1503-1505.

[3]Suzuki S Nanki .J Shibata S et al The neural stem/progenitor cellmadcernestin is expressed in proliferative endothelial cells but not in mature vasculaiure[J].J Histochen Cytochen，2010，58（8）：721-730.

[4]周華威， 趙寶東， 文普帥. 神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)局灶性腦缺血神經(jīng)干細(xì)胞巢蛋白表達(dá)及細(xì)胞類(lèi)型的影響[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，2（7）：1222-1224.

[5]王軍，范亞珍，陳海，等.臍血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞中Foxgl和Nestin基因的表達(dá)及其相互關(guān)系[J].實(shí)用兒科臨床雜志，2010，25（11） ：848-850.

[6]Lee ，J W ， Krasnodembskaya A，et al. Concise，review ：Mesenchymal stem cells for acute lung injure：role of paracrine soluble factors [J].Stem Cells. 2011.29（6）：913-919.

[7]烏優(yōu)圖，王運(yùn)杰. 神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化及神經(jīng)元軸突形成的影響[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12（29）：5631-5635.

[8]Woodbury D， Scbwarz EJ，Prockop DJ，et al. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons[J].J Neuro Res， 2000，61（4）：364-364.