曾曉琮

周 露1,2

蘇妙貞1,2

韓志杰1,2

陳丹霞1,2

(1. 廣東省食品檢驗所，廣東 廣州 510435；2. 廣東省酒類檢測中心，廣東 廣州 510435)

?

81株銅綠假單胞菌16S rRNA基因序列測定及系統(tǒng)發(fā)育學分析

曾曉琮1,2

周 露1,2

蘇妙貞1,2

韓志杰1,2

陳丹霞1,2

(1. 廣東省食品檢驗所，廣東 廣州 510435；2. 廣東省酒類檢測中心，廣東 廣州 510435)

；采用16S rRNA基因序列分析法對2015年7～9月廣東省食品檢驗所桶裝水專項抽檢中篩查所得的81株銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)進行復(fù)核鑒定。菌株經(jīng)純化培養(yǎng)后提取總DNA，采用細菌16S rRNA通用引物進行16S rRNA基因序列擴增，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，進行序列測定，序列經(jīng)人工校對后用Clustal X進行比對分析，最后用MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明：81株銅綠假單胞菌與原鑒定結(jié)果一致。其中，編號24-3-QY、100-5-JM、106-3-JM菌株形成一個分支，28-1-WD單獨為一支，其余77株野生菌和銅綠假單胞菌標準菌株ATCC27853聚為一群。該研究是2015年5月24日中國開始實施GB 19298—2014《食品安全國家標準 包裝飲用水》以來，廣東省首次對水源性銅綠假單胞菌進行的研究，為下一步菌種污染朔源等研究提供依據(jù)。

銅綠假單胞菌；16S rRNA基因；序列分析；系統(tǒng)發(fā)育樹

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)又稱為綠膿桿菌，1872年由Schroeter命名，在分類學上屬于細菌界變形菌門γ-變形菌綱假單胞菌目假單胞菌科假單胞菌屬，為無芽孢端生單鞭毛革蘭氏陰性小桿菌，典型嗜氧化能異養(yǎng)代謝。該菌在自然界分布廣泛，存在于水、土壤、空氣以及人和動物皮膚及腸道中[1]。該菌具有強大的環(huán)境適應(yīng)性和生存能力，尤其適應(yīng)潮濕的環(huán)境，甚至能適應(yīng)太空微重力環(huán)境，形成生物被膜而呈現(xiàn)出地球上未曾見過的獨特柱狀冠層結(jié)構(gòu)[2]。該菌是重要的食源性致病菌之一，能感染擬南芥[3]和窩苣[4-5]等較高等植物，能感染新桿狀線蟲[6-7]、果蠅[8]和大蠟螟[9]等無脊椎動物。更嚴重的是，銅綠假單胞菌也能感染免疫力下降或缺失的病人、囊性纖維化病人、燒傷和手術(shù)患者，會引發(fā)炎癥和敗血癥，假如該菌在人體重要器官如肺部、尿道和腎臟定植，則可能會危及生命[10]。但對于健康者來說，銅綠假單胞菌是機會性致病菌。

近年來，飲水安全越來越受到人們的重視，飲用水中銅綠假單胞菌的污染情況也日漸受到關(guān)注。2012年李飛[11]在廣東省礦泉水廠和山泉水廠采集了206份水樣，其中43份水樣檢測出有銅綠假單胞菌，污染率為20.9%。徐勵琴等[12]在2012～2013年間對惠州市80批次的桶裝水檢測中共檢出8份水樣含有銅綠假單胞菌，污染率為10.0%。2013年魏磊[13]對全國9個省36家廠家108份水樣中篩查出36株銅綠假單胞菌。2015年，蔡雙福[14]在廣東市場上168份水樣檢測中檢出2份水樣含有銅綠假單胞菌，不合格率為1.2%。Silva M.E.Z等[15]從自來水、瓶裝礦泉水和井水中分離得到的30株銅綠假單胞菌，并進行了藥敏毒力因子等相關(guān)研究。Venier D.等[16]調(diào)查了希臘國內(nèi)的瓶裝礦泉水中微生物情況，從1995～2003年間共采集1 527份樣品，檢出90份銅綠假單胞菌，污染率為5.9%。

中國關(guān)于飲用水的標準有GB 5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標準》、GB 8537—2008《飲用天然礦泉水》及2015年5月24日開始實施的GB 19298—2014 《食品安全國家標準 包裝飲用水》。GB 19298—2014代替了GB 19298—2003《瓶(桶)裝飲用水衛(wèi)生標準》、GB 17324—2003《瓶(桶)裝飲用純凈水衛(wèi)生標準》、GB 17323—1998《瓶裝飲用純凈水》，對包裝飲用水中致病菌的檢測設(shè)定了更嚴格的要求，即同一批次5份樣品中不得檢出銅綠假單胞菌。為保障廣大人民群眾飲水安全，針對GB 19298—2014《食品安全國家標準 包裝飲用水》新標準的實施，廣東省食品檢驗所在2015年7～9月開展了廣東省桶裝飲用水專項抽檢。從中篩查出81株野生型銅綠假單胞菌，在此基礎(chǔ)上，本研究期望通過16S rRNA基因序列分析法，在分子生物學水平上對81株野生型銅綠假單胞菌進行復(fù)核鑒定，旨在為建立具有廣東特色的水源性銅綠假單胞菌菌種資源庫和朔源數(shù)據(jù)庫奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

1.1.1 樣品來源

1株銅綠假單胞標準菌株ATCC 27853：廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司；

81株野生型菌株(見表1)：均是2015年7～9月廣東省食品檢驗所桶裝水專項抽檢中依據(jù)GB/T 8538—2008《飲用天然礦泉水檢驗方法》、GB 19298—2014《食品安全國家標準 包裝飲用水》篩查所得。

表1 試驗所用野生型菌株Table 1 Wild type strains used in our research

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

營養(yǎng)肉湯：廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司；

DNA提取試劑盒和DNA marker 2000：日本Takara公司；

電泳級瓊脂糖：西班牙Biowest公司；

超純水、2*HsTMMix、50*TAE、Gold View：廣州民塞生物科技有限公司；

PCR引物由北京華大基因研究中心合成。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

Biometra DNA擴增循環(huán)儀：T-professional thermocycler型，德國Biometra公司；

UVP凝膠成像儀：ImageQuant 350 system型，美國GE Healthcare公司；

微量核酸測定儀：NANO型，日本島津公司；

全自動滅菌鍋：SX-700型，日本Tomy公司；

超凈工作臺：SW-CJ-2FD型，中國蘇凈安泰公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：DHP-9052型，上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌體培養(yǎng) 將保存于30%甘油、-80 ℃的銅綠假單胞菌復(fù)壯培養(yǎng)后，在平板上劃線分離，培養(yǎng)18 h后挑取單菌落接種到15 mL液體培養(yǎng)基中，36 ℃培養(yǎng)18 h。

1.2.2 DNA提取 按照Takara DNA Extraction Kit Ver.3.0提取81株野生型銅綠假單胞菌和1株銅綠假單胞菌標準菌株ATCC 27853總DNA，用微量核酸測定儀檢測DNA的A260 nm/A280 nm值。提取的DNA保存于-20 ℃冰箱中。

1.2.3 PCR擴增及電泳檢測 根據(jù)文獻[17]的方法，選用27F/1492R擴增16S rRNA基因片段，正向引物序列27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物序列1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。擴增反應(yīng)在Biometra TProfessional PCR儀上進行。反應(yīng)體積為25 μL，其成分為：2 μL DNA模板(濃度25 μg/μL)，2 μL引物(濃度10 μmol/L)，12.5 μL 2*HsTMMix，超純水補足25 μL。擴增程序為：首先95 ℃預(yù)變性5 min；然后94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共進行35個循環(huán)；最后 72 ℃延伸5 min。擴增結(jié)束后用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物(含0.005% Goldview staining)。

1.2.4 序列測定 16S rRNA基因序列測定由北京華大基因研究中心完成。

1.2.5 16S rRNA基因序列分析與構(gòu)建 參考程池等[18]的方法，采用序列圖譜軟件Chromas，參照正、反向序列圖譜，對序列人工校對。將81株野生型菌株的16S rRNA基因序列在NCBI上用BLAST進行同源性比較。從GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中下載假單胞屬惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida，NC 002947.3)的16S rRNA基因序列，與銅綠假單胞標準菌株ATCC 27853及81株野生型菌株序列一起，用Clustal X軟件進行序列比對(alignment)，然后利用MEGA 5.1生物學軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Neighbor-Joining法進行系統(tǒng)發(fā)育分析，并進行1 025次重復(fù)的Boot-straps統(tǒng)計學檢驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種DNA PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳檢測與分析

銅綠假單胞菌標準菌株ATCC 27853和81株野生型菌株DNA提取后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果見圖1，所提取片段均約為1 425 bp的特異條帶，與預(yù)期大小相符。

M. Marker C. 陽性對照 N. 陰性對照圖1 81株銅綠假單胞菌16S rRNA 的PCR擴增產(chǎn)物Figure 1 16S rRNA PCR amplification products of 81Pseudomonas aeruginosa

2.2 16S rRNA基因序列分析及系統(tǒng)樹構(gòu)建

隨著核酸測序技術(shù)的發(fā)展，通過16S rRNA 基因的序列測定，從分子遺傳進化和分子水平上對細菌進行鑒定，已得到越來越廣泛的應(yīng)用，也越來越科學[19]。16S rRNA基因序列被稱為“細菌化石”，因為在漫長的生物進化過程中，16S rRNA基因序列的變化非常緩慢，具有高度的保守性，可以用來標記生物的進化距離和親緣關(guān)系，而利用16S rRNA序列中可變區(qū)序列的差異，則可以鑒定不同菌屬、菌種的細菌。16S rRNA 基因序列是細菌分類鑒定的主要依據(jù)之一，研究[20]表明，16S rRNA序列同源性小于97%，屬于不同的種，同源性小于93%～95%，則屬于不同的屬。程池等[18]采用16S rRNA基因序列分析法對中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心保藏的55株枯草芽孢桿菌進行復(fù)核鑒定，發(fā)現(xiàn)有3株菌種與原鑒定結(jié)果存在差異。張曉娟等[21]采用16S rRNA基因序列分析對西南菌種站收集保藏的23株芽孢桿菌進行了復(fù)核鑒定，發(fā)現(xiàn)有13株與原學名一致，有9株需要進一步核實。朱飛舟等[22]通過16S rRNA基因序列分析鑒定14種病原細菌，發(fā)現(xiàn)其中12種細菌可以鑒定到“種”，2種細菌可以鑒定到“屬”。劉大佳等[23]采用16S rRNA基因分析技術(shù)鑒定正畸患者矯治前齦溝液的細菌種類，共鑒定出43株菌。吳至成等[24]對不同地理種群棲稻假單胞菌株進行了16S rRNA基因序列分析，發(fā)現(xiàn)大部分棲稻假單胞菌可根據(jù)16S rRNA基因序列鑒別不同地理種群株。

本研究將81株野生型菌株的16S rRNA基因序列在NCBI上用BLAST進行同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)81株菌與銅綠假單胞桿菌模式菌(NC 002516.2)的同源性均在99%～100%，由此可以判定81株野生菌均為銅綠假單胞菌。圖2是以假單胞菌屬中惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida，NC 002947.3)為外群的16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹，從系統(tǒng)發(fā)育樹上看，81株分離株和1株標準菌株分成了3個大的分支，編號7(24-3-QY)，33(100-5-JM)，42(106-3-JM)形成一個分支，編號13(28-1-DG)單獨為一支，其余77株野生菌和標準菌株ATCC 27853聚為一群。圖2所示銅綠假單胞菌群內(nèi)16S rRNA差異非常小，當這些序列在Cluster X構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹時，由于序列差異太小，系統(tǒng)發(fā)生樹不會顯示其清晰的分析結(jié)構(gòu)。這也從反面說明了它們的高度相似性和一致性[25]。

標尺表示0.5%的序列差異；分支上的數(shù)據(jù)表示Bootstrap值圖2 基于16S rRNA基因序列的81株銅綠假 單胞菌系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 The phylogenetic tree of 81 Pseudomonasaeruginosa based on 16S rRNA sequence

3 結(jié)論

本研究采用16S rRNA基因序列分析法對廣東省食品檢驗所2015年7～9月桶裝水專項抽檢中篩查所得的81株銅綠假單胞菌進行復(fù)核鑒定。經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)，81株野生菌與GenBank中銅綠假單胞桿菌模式菌的同源性均在99%～100%，81株野生菌均為銅綠假單胞菌。從系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，81株分離株和1株標準菌株分成了3個分支，清遠24-3-QY，江門100-5-JM，江門106-3-JM形成一個分支，東莞28-1-DG菌株單獨為一支，其余77株野生菌和標準菌株ATCC 27853聚為一群。本研究推測地域可能是造成菌株16S rRNA變異的主要原因[26]。而同屬于一支的江門分離株100-5-JM、106-3-JM來自同一地區(qū)的不同廠家，兩者是否存在聯(lián)系，是否存在交叉污染，則有待進一步調(diào)查研究。

本研究是2015年5月24日中國開始實施GB 19298—2014《食品安全國家標準 包裝飲用水》以來，廣東對全省重要城市的水源性銅綠假單胞菌進行的研究，初步建立了具有廣東特色的水源性銅綠假單胞菌菌種資源庫，為飲用水中銅綠假單胞菌的風險識別及污染朔源提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，對保障該省居民飲水安全具有重要意義。對本研究中所復(fù)核鑒定的銅綠假單胞菌進行藥敏分析、毒力因子分析以及分子分型研究將會是下一步研究的重點。

[1] 聞玉梅. 現(xiàn)代醫(yī)學微生物學[M]. 上海: 上海醫(yī)科大學出版社, 1999: 383-389.

[2] KIM W, TENGRA FARAH K, YOUNG Z, et al. Spaceflight promotes Biofilm Formation byPseudomonasaeruginosa[J]. PLOS One, 2013, 8(4): 624-627.

[3] WALKER T S, BAIS H P, DEZIEL E, et al,Pseudomonasaeruginosa-plant root interactions. Pathogenicity, biofilm formation, and root exudation [J]. Plant Physiol, 2004, 134(1): 320-331.

[4] RAHME L G, STEVENS E J, WOLFORT S F, et al. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals[J]. Science, 1995, 268(5 219): 1 899-1 902.

[5] RAHME L G, TAN M W, LE L, et al. Use of model plant hosts to identifyPseudomonasaeruginosavirulence factors[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94(24): 13 245-13 250.

[6] MAHAJAN-MIKLOS S, TAN M W, RAHME L G, et al. Molecular mechanisms of bacterial virulence elucidated using aPseudomonasaeruginosa-Caenorhabditiselegant pathogenesis model [J]. Cell, 1999, 96(1): 47-56.

[7] MARTINEZ C, PONS E, PRATS G, et al. Salicylic acid regulates flowering time and links defense responses and reproductive development[J]. Plant J, 2004, 37(2): 209-217.

[8] DARGENIO D A, GALLAGHER L A, BERG C A, et al. Drosophila as a model host forPseudomonasaeruginosainfection [J]. J Bacterial, 2001, 183(4): 1 466-1 471.

[9] MIYATA S, CASEY M, FRANK D W, et al. Use of the Galleria mellondla caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system inPseudomonasaeruginosapathogenesis[J]. Infect Immune, 2003, 71(5): 2 404-2 413.

[10] BALTCH A L, SMITH R P.Pseudomonasaeruginosa: infections and treatment[J]. New York: M.Dekler,1994: 83-84.

[11] 李飛. 包裝飲用泉水食源性致病菌分布規(guī)律和遺傳多樣性研究[D]. 廣州: 華南理工大學, 2013: 35-36.

[12] 徐勵琴, 薛計泉, 羅澤燕, 等. 桶裝飲用水銅綠假單胞菌檢測及耐藥性分析[J]. 海峽預(yù)防醫(yī)學雜志, 2015, 21(3): 56-57.

[13] 魏磊, 吳清平, 張菊梅, 等. 礦泉水和山泉水中銅綠假單胞菌污染調(diào)查及分離菌株毒力基因與耐藥性分析[J]. 微生物通報, 2015, 42(1): 125-132.

[14] 蔡雙福, 張琴, 黃耀雄. 食品中銅綠假單胞菌的監(jiān)測分析[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2015, 26(3): 875-905.

[15]SILVAME,FILHOIC,ENDOEH,etal.Characterisationofpotentialvirulencemarkersinpseudomonas aeruginosaisolatedfromdrinkingwater[J].AntonieVanLeeuwenhoek, 2008, 93(4): 323-334.

[16]VENIERID,VANTARAKISA,KOMNINOUG,etal.Microbiologicalevaluationofbottlednon-carbonated(“still”)waterfromdomesticbrandsinGreece[J].IntJFoodMicrobiol, 2006, 107(1): 68-72.

[17]LAVENIRR,JOCKTANED,LAURENTF,etal.ImprovedreliabilityofPseudomonas aeruginosaPCRdetectionbytheuseofthespecies-specificecfXgenetarget[J].JournalofMicrobiologicalMethods, 2007, 70: 20-29.

[18] 程池, 劉光全, 李金霞, 等. 55株芽孢桿菌16SrRNA基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育學分析[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2006, 32(10): 20-24.[19]TENGLJ,HSUEHPR,HUANGYH,etal.IdentificationofBactericides thetaiotaomicrononthebasisofanunexpectedspecificapplicantofUniversal16SRibosomalDNAPCR[J].JournalofClinicalMicrobiology, 2004, 42(4): 1 727-1 730.

[20]STACKEBRANDTEB,GOEBELBM.Taxonomicnote：aplaceforDNA-RNAreassociationand16SrRNAsequenceanalysisinthepresentspeciesdefinitioninbacteriology[J].IntJSystBacteriol, 1994, 44: 842-849.

[21] 張曉娟, 宋萍, 王柱, 等. 23株芽孢桿16SrRNA基因序列擴增與系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 食品與發(fā)酵科技, 2012, 48(2): 9-12.

[22] 朱飛舟, 陳利玉, 陳漢春. 16SrRNA基因序列分析法鑒定病原細菌[J]. 中南大學學報: 醫(yī)學版, 2013, 38(10): 1 035-1 041.

[23] 劉大佳, 楊明, 陳利玉, 等. 采用16SrRNA基因分析技術(shù)鑒定正畸患者矯治前齦溝液的細菌種類[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志, 2016, 26(2): 43-46.

[24] 吳至成, 伍麗嫻, 李麗花, 等. 不同地理種群棲稻假單胞菌株的16SrRNA基因序列分析[J]. 中國熱帶醫(yī)學, 2012,12(12): 1 453-1 456.

[25] 鄒寰, 喻子牛, 孫明. 蠟狀芽胞桿菌群16SrDNA分析[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學學報, 2008, 27(4): 478-482.

[26] 趙耘, 杜昕波, 李偉杰, 等. 袋鼠源銅綠假單胞菌分離鑒定[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學報, 2010, 32(2): 139-141.

Identification of 81 Pseudomonas aeruginosa by phylogenetic analysis of 16S rRNA gene sequence

ZENG Xiao-cong1,2

ZHOULu1,2

SUMiao-zhen1,2

HANZhi-jie1,2

CHENDan-xia1,2

(1.GuangdongProvincialInstituteofFoodInspection,Guangzhou,Guangdong510435,China;2.GuangdongProvincialLiquorTestingCenter,Guangzhou,Guangdong510435,China)

81Pseudomonasaeruginosafrom Guangdong Provincial Institute of Food Inspection were identified by 16S rRNA sequence analysis. The DNA was isolated and the sequences of 16S rRNA gene were amplified by PCR with the bacterium universal primers, and then the PCR products were sequenced after 2% agarose gel electrophoresis. Moreover, the corrected sequences were aligned with Clustal X and the phylogenetic tree was constructed by MEGA5.1. Consequently, the identified results of the 81 strains confirmed their original identification before. On the phylogenetic tree, No. 24-3-QY strain formed a separate branch with No. 100-5-JM strain and No. 106-3-JM strain. No.2 8-1-DW formed one branch and the other 77 strains formed a separate branch withP.aeruginosaATCC 27853. This was the first research about waterborneP.aeruginosain Guangdong Province when China began to implement GB 19298—2014 “National food safety standards of packaged drinking water” since May 24, 2015. The waterborneP.aeruginosaculture collection in Guangdong was preliminarily established basing on these strains. These data will provide a powerful tool for effectively tracing source ofP.aeruginosaand controlling the water contamination in future.Keywords：Pseudomonasaeruginosa; 16S rRNA gene; gene sequence analysis; phylogenetic tree

曾曉琮，男，碩士。

周露(1982— )，女，廣東省食品檢驗所高級工程師，博士。E-mail: zhoulu1982@sohu.com

2016—05—12

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.11.005