郭寶健，李 贏，袁澤宸，呂 超，張新忠，許如根

(江蘇省作物遺傳生理國家重點實驗室培育點/糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心/教育部植物功能基因組學(xué)重點實驗室/揚州大學(xué)大麥研究所，江蘇揚州 225009)

大麥ARF基因家族的全基因組分析

郭寶健，李 贏，袁澤宸，呂 超，張新忠，許如根

(江蘇省作物遺傳生理國家重點實驗室培育點/糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心/教育部植物功能基因組學(xué)重點實驗室/揚州大學(xué)大麥研究所，江蘇揚州 225009)

生長素響應(yīng)因子(auxin response factor,ARF)基因家族是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，在調(diào)控植物生長發(fā)育過程中起到重要作用。而關(guān)于大麥ARF基因家族全基因組分析的研究尚未見報道。為進一步探討大麥ARF基因的功能，以公布的大麥栽培品種Morex的基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，采用生物信息學(xué)方法鑒定了大麥ARF基因，并對其結(jié)構(gòu)、染色體分布、蛋白保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進化樹及表達譜進行了分析。結(jié)果表明，共鑒定出了17個大麥ARF基因，除4號染色體外，其余6條染色體上均有分布，片段復(fù)制事件是大麥ARF基因家族的主要擴張方式；HvARF蛋白均具有保守的B3結(jié)構(gòu)域和Auxin_resp結(jié)構(gòu)域，而Aux/IAA結(jié)構(gòu)域僅存在于12個HvARF蛋白中，且不同蛋白所含該結(jié)構(gòu)域1～2個不等；不同植物中ARF基因在功能上具有保守性；不同組織器官中HvARF基因的表達存在明顯的差異。

大麥；生長素響應(yīng)因子；進化樹；表達譜

生長素響應(yīng)因子(auxin response factor,ARF)基因家族是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，調(diào)控生長素響應(yīng)的基因表達[1-3]。絕大多數(shù)的ARF蛋白具有3個保守的結(jié)構(gòu)域，即N-末端B3 DNA結(jié)合域(DNA-binding domain,DBD)，具有DNA結(jié)合活性，能直接與生長素調(diào)控的下游基因啟動子區(qū)的AuxREs結(jié)合；中間區(qū)域(Auxin_resp結(jié)構(gòu)域)，具有激活結(jié)構(gòu)域(AD)或抑制結(jié)構(gòu)域(RD)活性，具有激活或抑制轉(zhuǎn)錄子活性的作用；C末端二聚化結(jié)構(gòu)域(CTD)，即AUX/IAA結(jié)構(gòu)域，與Aux/IAAs蛋白C-末端的結(jié)合域Ⅲ和Ⅳ高度保守，介導(dǎo)Aux/IAAs和ARFs的同源二聚化和異源二聚化的區(qū)域，調(diào)節(jié)ARFs與AuxREs的結(jié)合并調(diào)控下游生長素響應(yīng)基因的表達[2,4-5]。

目前，植物中已克隆到大量的ARF基因，部分基因的功能也得到鑒定[3,6-7]。 AtARF5(MONOPTEROS)是植物中第一個通過圖位克隆方法鑒定的ARF基因，該基因在胚模式建成、維管組織正常形成過程中起重要作用[6]。 AtARF7和 AtARF19是報道最多的ARF基因。擬南芥中， arf7突變體植株主要表現(xiàn)為下胚軸的向光性和對生長素運輸抑制劑NPA的抗性， arf19突變體植株相對于野生型的表型沒有明顯的變化， arf7arf19雙突變除了表現(xiàn)出單突變的表型外，側(cè)根數(shù)目嚴重減少，即 AtARF7與 AtARF19在功能上有一定的冗余，在擬南芥?zhèn)雀l(fā)生過程中起重要作用[7-9]。 AtIAA14和 AtLBD16/29與 AtARF7/19共同參與了擬南芥的側(cè)根發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[10-11]。Attia等[12]研究表明，降低 OsARF1基因的表達量，轉(zhuǎn)基因水稻株系表現(xiàn)出種子活力低、發(fā)育遲緩、葉片短而卷曲和不育，表明 OsARF1對營養(yǎng)器官和生殖器官的發(fā)育都起著重要作用。

許多植物的ARF基因家族已得到系統(tǒng)分析，如擬南芥中有23個ARF基因、玉米中有31個ARF基因、水稻中有25個ARF基因、谷子中有24個ARF基因[7,13-17]。大麥是世界上第四大禾谷類作物，具有廣泛的適應(yīng)性和用途，栽培歷史悠久。2012年，大麥全基因組測序完成，為大麥分子生物學(xué)研究奠定了良好的基礎(chǔ)[18]。目前，大麥中還沒有ARF基因家族分析的報道，也缺少對該基因家族的生物信息學(xué)分析和表達分析，因此有必要在大麥基因組測序完成的基礎(chǔ)上對ARF基因家族進行系統(tǒng)分析。本研究利用生物信息學(xué)方法在全基因組水平上鑒定大麥ARF基因，并對其基因結(jié)構(gòu)、染色體分布、蛋白保守結(jié)構(gòu)域、分子進化及表達譜進行分析，以期為進一步探討大麥ARF基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 大麥ARF基因家族成員的鑒定及其編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

利用國際大麥基因組測序聯(lián)盟公布的大麥基因組數(shù)據(jù)[18]，以已報道的擬南芥[7]、水稻[13]和玉米[14-16]的ARF蛋白序列作為引用數(shù)據(jù)，在IPK (http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)和Gramene((http://gramene.org/)數(shù)據(jù)庫中進行BLASTP比對(e-value<1e-5)，搜索這些序列的同源蛋白，刪除重復(fù)序列。大麥ARF候選基因的蛋白質(zhì)序列利用在線軟件Pfam (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/search.shtml)進行保守結(jié)構(gòu)域分析[19]，篩選含有 B3結(jié)構(gòu)域、Auxin_resp結(jié)構(gòu)域和AUX_IAA 結(jié)構(gòu)域的序列，剔除冗余蛋白。借助Expasy (http://www.expasy.org/)在線軟件計算大麥ARF蛋白的等電點和分子量[20]。

1.2 大麥ARF基因的結(jié)構(gòu)、染色體定位和啟動子序列分析

從Gramene數(shù)據(jù)庫中檢索大麥ARF基因的信息，包括內(nèi)含子、外顯子、染色體上的物理位置信息和啟動子序列。采用GSDS (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析大麥ARF基因的內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)[21]。利用MapDraw軟件構(gòu)建染色體定位圖[22]。按照大麥ARF基因在染色體上的排列順序進行基因命名。在PlantCARE數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/)中輸入大麥ARF基因的啟動子序列，預(yù)測生長素響應(yīng)元件[24]。

1.3 分子進化樹的構(gòu)建

利用Muscle軟件對大麥、玉米、水稻和擬南芥ARF蛋白序列進行多序列比對，將比對結(jié)果輸入MEGA 6.0，采用鄰接法(neighbor-joining,NJ) 分別構(gòu)建大麥ARF基因家族進化樹及大麥、玉米、水稻和擬南芥的系統(tǒng)進化樹，其中，校驗參數(shù)(bootstrap)設(shè)置為1 000，其余均為默認參數(shù)[25]。片段復(fù)制事件參照Maher等[23]的方法，查找旁系同源基因上游和下游各10個編碼蛋白的基因，如在ARF基因的兩側(cè)還存在旁系同源基因?qū)?，則表明該ARF旁系同源基因?qū)ζ鹪从谄螐?fù)制事件。

1.4 大麥ARF基因的表達譜分析

利用已公布的大麥RNA-seq數(shù)據(jù)，檢索大麥ARF基因的表達譜(http://apex.ipk-gatersleben.de/apex/f?p=284:10:6281639160219::NO)[18]。數(shù)據(jù)庫中提供了大麥栽培品種Morex的8個組織器官的表達數(shù)據(jù)，包括種子萌發(fā)后4 d的胚、幼苗的根和嫩芽、幼穗(5 mm和1～1.5 cm)、六葉期的分蘗、開花后5 d和15 d的籽粒(去稃殼)，獲取數(shù)據(jù)庫中8個組織器官的FPKM(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)值，作為組織表達譜數(shù)據(jù)，構(gòu)建基因表達熱圖。圖中用綠色和紅色表示基因表達的強度，綠色越亮表示基因表達量越低，紅色越亮表示基因表達量越高。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麥ARF基因的染色體定位及理化性質(zhì)

利用已報道的31個玉米ARF基因、25個水稻ARF基因和23個擬南芥ARF基因序列在IPK (http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)和Gramene (http://gramene.org/)數(shù)據(jù)庫中進行BLASTP比對，得到35個大麥候選ARF基因。利用Pfam (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/search.shtml) 對獲得的大麥候選ARF基因編碼蛋白質(zhì)序列進行保守結(jié)構(gòu)域分析，剔除不含有典型ARF結(jié)構(gòu)域的冗余蛋白后，獲得17個大麥ARF基因。這17個大麥ARF基因分布于除4H染色體外的其余6條染色體上，3H和7H上含有的基因數(shù)目最多，均為4個，其次為2H和6H，均為3個，1H和5H上含有的ARF基因數(shù)目最少，分別為2個和1個(圖1)。按照大麥ARF基因在染色體上的排列順序命名為 HvARF1～ HvARF17(圖1)。序列分析顯示，17個HvARF基因編碼區(qū)長度在1 356～3 387 bp之間，編碼長度為452～1 129個氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為50.35～125.38 kDa，等電點范圍為5.77～8.92(表1)。

2.2 大麥ARF基因的結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進化樹

利用本研究中大麥ARF全長蛋白序列構(gòu)建大麥系統(tǒng)進化樹，結(jié)果(圖2A)顯示，在17個編碼大麥ARF蛋白的基因中檢測到了5個旁系同源基因?qū)?，?HvARF1和 HvARF16、 HvARF2和 HvARF7、 HvARF8和 HvARF9、 HvARF11和 HvARF15、 HvARF12和 HvARF17?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明，不同大麥ARF基因所含外顯子差異很大，其中， HvARF3、 HvARF5、 HvARF6、 HvARF9、 HvARF10和 HvARF11均含有14個外顯子， HvARF4、 HvARF14和 HvARF17均含有13個外顯子， HvARF8、 HvARF12和 HvARF15均含有12個外顯子，而 HvARF1、HvARF13和 HvARF16則均含有3個外顯子， HvARF2和 HvARF7則均含有2個外顯子(圖2B)。旁系同源基因?qū)Φ幕虿介L值為100的基因?qū)? HvARF2和 HvARF7、 HvARF8和 HvARF9、 HvARF11和 HvARF15)含有相似數(shù)目的外顯子(圖2B)。片段復(fù)制和串聯(lián)重復(fù)是家族基因擴張的主要模式，分析發(fā)現(xiàn)， HvARF1和 HvARF6、 HvARF4和 HvARF5基因?qū)Υ嬖谄螐?fù)制事件；在Gramene數(shù)據(jù)庫中通過Gbrowse查看成簇分布的ARF基因家族成員與相鄰蛋白質(zhì)編碼基因的位置關(guān)系，未發(fā)現(xiàn)大麥ARF基因家族成員位于同一個或相鄰的基因間區(qū)域，即大麥中ARF基因家族的擴張不存在串聯(lián)重復(fù)方式，表明片段復(fù)制是大麥ARF基因家族擴張的主要方式。大麥(17個)、玉米(31個)、水稻(25個)及擬南芥(23個)ARF基因的系統(tǒng)進化樹分析表明，來自4個植物的96個ARF基因分為6個類別(ClassⅠ～Ⅵ)[26]，而本研究中得到的17個大麥ARF基因歸于ClassⅠ～ClassⅤ類別(圖3)。

圖1 大麥ARF基因的染色體定位

表1 大麥ARF家族基因的基本信息

Table 1 The basic information of ARF gene family in barley

基因名稱Genename基因號GeneID染色體Chromosome物理位置Physicalposition編碼區(qū)長度Codingsequencelength/bp氨基酸長度Aminoacidlength/aa分子量MW/Da等電點pIHvARF1MLOC_64795.11H127102527～127107560206468874246.737.59HvARF2MLOC_38232.11H419398338～419403571180060065937.558.77HvARF3MLOC_64596.12H508740133～508745733197465873058.305.81HvARF4MLOC_55345.62H589588539～5895952242871957105593.965.79HvARF5MLOC_51932.12H615547380～615555915250883692948.875.85HvARF6MLOC_65945.13H141906589～141910998228676284195.966.24HvARF7MLOC_66439.13H435834578～435839922164154759634.608.84HvARF8MLOC_68907.13H523997002～524001458224174783941.846.27HvARF9MLOC_18401.13H529062935～529067687247882692329.446.03HvARF10MLOC_63938.15H22704804～22710863267389198194.835.77HvARF11MLOC_73144.46H69851096～6985889633871129125382.045.98HvARF12MLOC_66152.26H124383735～124387564135645250346.196.90HvARF13MLOC_77438.26H247346568～247349350210970376028.868.92HvARF14MLOC_14584.17H202204080～20221199932491083120278.156.00HvARF15MLOC_63193.27H533232921～53324135633031101123570.716.20HvARF16MLOC_69988.17H545375651～545378650209169775629.948.13HvARF17MLOC_58330.27H561567257～5615740832814938103351.366.14

圖2 大麥ARF基因家族的系統(tǒng)進化樹(A)和基因結(jié)構(gòu)(B)

圖3 大麥、玉米、水稻和擬南芥ARF基因的進化樹分析

2.3 大麥ARF基因的啟動子元件預(yù)測結(jié)果

利用PlantCARE軟件對HvARF基因起始密碼子上游2 kb的DNA序列分析表明，6個HvARF基因含有生長素響應(yīng)元件(TGA-element，AACGAC)，其中， HvARF16含有兩個生長素響應(yīng)元件，分別位于啟動子正義鏈(1 130 bp)和反義鏈(-1 341 bp)； HvARF1、 HvARF7和 HvARF13基因的生長素響應(yīng)元件均位于正義鏈(1 523 bp、1 340 bp、1 249 bp)； HvARF2和 HvARF15基因的生長素響應(yīng)元件均位于反義鏈(-1 427 bp、-1 887 bp)。

2.4 大麥ARF蛋白的保守結(jié)構(gòu)域

利用Pfam軟件分析了大麥ARF蛋白的結(jié)構(gòu)域，結(jié)果(圖4)表明，所有大麥ARF蛋白都含有N-端DNA結(jié)合域(B3結(jié)構(gòu)域)，并具有激活或抑制活性的中間區(qū)域(Auxin_resp結(jié)構(gòu)域)，12個ARF蛋白含有C末端二聚化結(jié)構(gòu)域(AUX/IAA結(jié)構(gòu)域)，其中HvARF8和HvARF9分別含有2個AUX/IAA結(jié)構(gòu)域。

圖4 大麥ARF蛋白的保守結(jié)構(gòu)域

2.5 大麥ARF基因的表達譜

栽培品種Morex 8個組織器官的RNA-seq數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，17個HvARF基因中有12個在8個組織器官中檢測到了轉(zhuǎn)錄本。如圖5所示， HvARF3、 HvARF5、 HvARF10、 HvARF12和 HvARF17在幼穗(5 mm和1～1.5 cm)和六葉期的分蘗中具有較高的表達量，此外， HvARF3在幼苗期的根和嫩芽中也表現(xiàn)出了較高的表達量； HvARF1基因的轉(zhuǎn)錄本主要集中在六葉期的分蘗和開花后5 d的籽粒中，且隨著成熟度的提高，在籽粒中的表達量下降； HvARF11、 HvARF15和 HvARF16基因主要在六葉期的分蘗中表達； HvARF4基因的轉(zhuǎn)錄本主要集中在幼穗中； HvARF6和 HvARF13基因為組成型表達基因，并且在 8個組織器官中均表現(xiàn)出低表達模式。

1：萌發(fā)后4天的胚；2：幼苗期的根；3：幼苗期的嫩芽；4：幼穗(5 mm)；5：幼穗(1～1.5 cm)；6：六葉期的分蘗；7：去稃殼籽粒(開花后5 d)；8：去稃殼籽粒(開花后15 d)。

1:Embryo four-day after germination;2:Roots at seedling stage;3:Shoots at seedling stage;4:Young inflorescences (5 mm);5:Young inflorescences (1～1.5 cm);6:Tillers at six-leaf stage;7:Developing grain with hulls removed (5 DPA);8:Developing grain with hulls removed (15 DPA).

圖5 大麥ARF基因在不同組織器官中的表達譜

Fig.5 Expression profile ofARFgenes in eight tissues of barley

3 討 論

本研究在大麥全基因組水平上共檢測到17個編碼ARF蛋白的基因，少于已報道的擬南芥(23個)、水稻(25個)、玉米(31個)、谷子(24個)等植物ARF基因家族成員數(shù)目[7,13-17]。片段復(fù)制是大麥ARF基因擴張的唯一方式，可能限制了大麥ARF基因家族的擴張。

ARF蛋白的系統(tǒng)進化樹分析表明，4個HvARF蛋白歸于ClassⅠ，其中 HvARF5、 HvARF10和HvARF17蛋白含有B3結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄激活活性的Auxin_resp結(jié)構(gòu)域和AUX/IAA結(jié)構(gòu)域三個保守的結(jié)構(gòu)域，同時編碼這三個蛋白的基因具有相似的表達模式，擬南芥中ClassⅠ的ARF蛋白同時含有三個保守的結(jié)構(gòu)域，其中AtARF7和AtARF19作為轉(zhuǎn)錄激活子介導(dǎo)了擬南芥?zhèn)雀纬蛇^程[7,26]，暗示 HvARF5、 HvARF10和 HvARF17基因可能存在相似的功能。本研究中5個HvARF蛋白歸于ClassⅡ，該類基因數(shù)目最多，除含有B3結(jié)構(gòu)域和AUX/IAA結(jié)構(gòu)域外，還含有轉(zhuǎn)錄抑制活性的Auxin_resp結(jié)構(gòu)域，僅有 HvARF3、 HvARF4和 HvARF9在八個組織器官中檢測到轉(zhuǎn)錄本，且表達模式存在明顯的差異，可能存在功能分化。同類的 AtARF3和 AtARF4編碼了兩個功能冗余的生長素響應(yīng)因子， arf3arf4雙突變體所有側(cè)生器官背腹結(jié)構(gòu)受到影響[27]。 HvARF2和 HvARF7基因與 AtARF3和 AtARF4基因同屬于Class Ⅲ，且 HvARF2與 AtARF3均不含有AUX/IAA結(jié)構(gòu)域[4]，表明這類基因在植物生長發(fā)育過程中具有不同的功能。ClassⅣ和ClassⅤ的B3結(jié)構(gòu)中含有額外的32～36個氨基酸，其余的保守結(jié)構(gòu)域分別與ClassⅡ和ClassⅢ相似， AtARF10、 AtARF16和 AtARF17基因的單突變體沒有明顯的表型，而 arf10arf16雙突變體根冠和根系向地性生長發(fā)生異常[7,28]，大麥中共有5個HvARF基因?qū)儆诖祟悇e，但是具體的功能還有待于進一步的探討。

本研究利用生物信息學(xué)方法在全基因組水平上分析了大麥ARF基因家族，并對其基因結(jié)構(gòu)、染色體分布、蛋白保守結(jié)構(gòu)域、分子進化及表達譜進行了分析，為進一步探討大麥ARF基因的功能奠定一定的基礎(chǔ)，但是關(guān)于大麥ARF基因如何調(diào)控生長素響應(yīng)的基因表達參與大麥生長發(fā)育還需要進一步的探討。

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Genome-Wide Analysis of Auxin Response Factor (ARF) Family in Barley

GUO Baojian,LI Ying,YUAN Zechen,Lü Chao,ZHANG Xinzhong,XU Rugen

(Jiangsu Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology/Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops/Key Laboratory of Plant Functional Genomics of the Ministry of Education/Barley Research Institution of Yangzhou University,Yangzhou,Jiangsu 225009,China)

Auxin response factor (ARF) gene family is the specific transcription factor in plant,and plays an important role in regulation of plant organ development.However,genome-wide analysis of the ARF gene family has not been reported in barley.In this study,HvARFgenes were identified based on the public genomic database of barley cultivar Morex by using bioinformatics methods.A comprehensive overview of theHvARFgenes was undertaken,including gene structure,chromosome position,conserved domain of proteins,phylogenetic tree and gene expression profiling.The results showed thatHvARFgenes located on all chromosomes except for 4H,and segmental duplication contributed to the expansion of the ARF gene family in barley;all HvARF proteins contain a conserved B3 domain and Auxin_resp domain,and twelve HvARF proteins contain one or two Aux/IAA domains;phylogenetic classification showed that the function ofARFgenes were conserved in different species;and gene expression analysis showed that the expression levels ofHvARFgenes were obviously different at different development stages in barley.

Barley;Auxin response factor;Phylogenetic tree;Expression profiling

時間：2016-11-04

2016-05-16

2016-10-13

國家自然科學(xué)基金項目(31401370；31571648)；國家大麥青稞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-05)；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項目(CX(14)2123)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目

E-mail：bjguo@yzu.edu.cn

許如根(E-mail:rgxu@yzu.edu.cn)

S512.3；S330

A

1009-1041(2016)11-1426-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20161104.0924.004.html